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1、实验二、黑曲霉发酵生产纤维素酶大实验一、实验目的 1、了解纤维素酶的生产工艺和原理2、掌握液体发酵和固体发酵工艺3、学会DNS法测定还原糖含量的方法和原理二、实验原理纤维素酶可以用于一切含纤维素的生物质的降解,具有广阔的应用前景。高产纤维素酶的微生物主要有木霉属、曲霉属、根霉属,黑曲霉所产的纤维素酶中-葡萄糖苷酶活力高,能避免酶解产物纤维二糖的阻遏作用,而且安全无毒,故而成为生产纤维素酶的主要菌种之一。纤维素酶是诱导酶,故发酵生产时需有纤维素物质作诱导剂。以羧甲基纤维素钠作底物,用发酵所得纤维素酶对底物进行酶解,测定酶解液中的还原糖含量(以葡萄糖计),可以计算酶活力高低。还原糖与DNS反应形成
2、棕色物质,颜色深浅与糖含量成正比。三、材料与试剂配制1、生产菌种:黑曲霉2、斜面(活化)培养基:酵母膏0.4%,蛋白胨0.6%,可溶性淀粉1%,葡萄糖0.9%,马玲薯浸出液7%,琼脂2%,陈海水(或人工海水)配制,pH7.0-7.4。3、人工海水:NaCl = 24 g/L ;MgSO47H2 O = 7.0 g/L ;NH4NO3 = 1 g/L ;KCl = 0.7 g/ L ; NaH2PO4 = 2.0 g/ L ;Na2HPO4 =3.0 g/ L ,pH7.4。4、微量元素液:FeSO47H2O5.0mg/L,MnSO4H2O1.6mg/L,ZnSO47H2O1.4mg/L,CoC
3、l22.0mg/L,加蒸馏水200ml使之溶解。 5、液体发酵产酶培养基:麸皮作碳源3 g,氯化铵或硫酸铵作无机氮源1 g,蛋白胨0.05g作有机氮源,人工海水100 ml(含1%微量元素液),自然pH值。6、固体发酵产酶培养基:麸皮:稻草粉=2:1作碳源5 g,人工海水12 ml(含1%微量元素液,1%氯化铵或硫酸铵,0.05%蛋白胨),自然pH值。7、6% DNS试剂:称取酒石酸钾钠182g溶于500ml水中,加热溶解,于热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸6g,20.8gNaOH,5g苯酚,5g无水亚硫酸钠,加热搅拌溶解,冷却后定容至1000ml。储存在棕色瓶中放置一周后使用。(提前配制
4、)8、0.1 mol/L 柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液(pH 4.8)0.1mol/L柠檬酸钠溶液100mL:称2.941克柠檬酸钠(柠檬酸钠的分子量为294.12),约20L蒸馏水溶解后,转入100mL溶量瓶,定容至刻度。0.1mol/L柠檬酸溶液100mL:称2.101克柠檬酸(柠檬酸的分子量为210.14),约20L蒸馏水溶解后,转入100mL溶量瓶,定容至刻度。pH4.8的柠檬酸钠柠檬酸缓冲液100mL:量取0.1mol/L柠檬酸钠溶液54mL和0.1mol/L柠檬酸溶液46mL混合摇匀。9 1%CMC-Na溶液称取1.0克羧甲基纤维素纳,用pH 4.8的柠檬酸钠柠檬酸缓冲液加热溶解。10
5、1mg.mL-1标准葡萄糖溶液1mg/mL葡萄糖溶液250mL: 准确称取无水葡萄糖250mg,溶解定容到250ml。11、主要仪器:恒温培养箱,摇床培养箱,可见光分光光度计、冷冻离心机、电子天平等。四、实验步骤1、培养基配制分别按上述方法配制液体发酵培养基和固体发酵培养基,121灭菌20分钟。2、孢子悬液的制备:将斜面培养基上的曲霉孢子用少量无菌人工海水洗下,利用玻璃珠在磁力搅拌下搅拌1520分钟,充分打散孢子,稀释成5x107个/ml左右的孢子悬液。2、液体发酵产酶试验按6%(v/v )接种量将浓度约为510 7 个/ml的菌株孢子悬液接入已灭菌的液体发酵培养基(100 ml 锥瓶装液30
6、 ml),于35、180r/min条件下摇床培养6天。发酵液4、5000 r/min离心15 min,上清液稀释10倍,测定发酵液中的酶活力。3、固体发酵产酶试验100 ml三角烧瓶装5g已灭菌的固体发酵培养基,按1:3(v/w)接种量将浓度约为510 7 个/ml的菌株孢子悬液,于35恒温培养箱中培养,接种48小时后隔天翻曲一次,第四或第五天补充无菌水保持基质水分。培养6天后,取发酵成熟曲1g,加蒸馏水10ml,搅拌均匀,30,浸提lh,双层纱布过滤,滤液经4,5000rmp离心15min,上清为粗酶液。测定时适当分级稀释,使OD540在0.21.0范围。4、酶活力测定及酶活力定义(!)葡萄
7、糖标准曲线绘制准确称取无水葡萄糖250mg,溶解定容到250ml。分别吸取此液1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 ml至5个25ml的比色管中,用蒸馏水定容到25ml(即加水24, 23, 22, 21, 20ml)再分别吸取上溶液各2.5ml于比色管中(糖液分别含糖量为0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mg),各加2.5mlDNS试剂,煮沸5min。(对照管2.5ml水代替糖液,冷却,测定OD540。表1 葡萄糖标准曲线绘制加样表管号123456蒸馏水(mL)2.5-标准葡萄糖(mL)-2.52.52.52.52.5DNS(mL)2.52.52.52.52.52.5含糖量(m
8、g)00.10.20.30.40.5OD540以糖含量为横坐标,A540为纵坐标,(或反过来)绘制标准曲线。(1)内切葡聚糖酶 (CMCase) 酶活:取适当稀释的酶液0.5 ml,加入2.0 ml 1 (W/V) 的CMC-Na溶液(溶于0.1 mol/L 柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液,pH 4.8),60 反应30 min,加入2.5 ml DNS 终止反应,沸水浴显色5 min,测定 OD540。以灭活酶液作对照。(2)滤纸酶 (FPA) 酶活:取50 mg (1 6 cm) 新华滤纸,加入酶液0.5 ml,再加入pH 4.8的柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液2.5 ml,50反应l h,其它同前。酶活
9、力定义:在上述反应条件下,每分钟催化底物水解生成1 mol葡萄糖所需的酶量为 1个酶活力单位 (U)。酶活力= 式中A为由标准曲线查得或回归方程算得的还原糖含量,mg。五、实验记录1.固体培养基: 6月20日接种 6月21日15点00分无现象 6月22日16点05分出现白色菌丝体 6月24日10点出现大量白色菌丝体和少量黑色孢子 6月25日8点出现大量黑色孢子,白色菌丝体比前天少些2.液体培养基: 6月20日接种 6月21日15点00分无现象 6月22日16点05分液体颜色变深了 6月24日10点液体变稠、变黑、出现少量黑色孢子 6月25日8点出现大量黑色孢子六、实验数据 1.葡萄糖标准曲线O
10、D数据管号123456蒸馏水(mL)2.5-标准葡萄糖(mL)-2.52.52.52.52.5DNS(mL)2.52.52.52.52.52.5含糖量(mg)00.10.20.30.40.5OD5400.0000.0410.3700.6771.0131.1522.酶活力测定OD数据管号液体培养基CMCase(10倍)液体培养基FPA(5倍)固体培养基CMCase(10倍)固体培养基FPA(10倍)OD5401.0910.6230.4970.695七、 数据处理实验数据:CMCase: OD540液体培养基=1.091 OD540固体培养基=0.497 FPA: OD540液体培养基=0.623
11、 OD540固体培养基=0.695又由y=2.5689x-0.0997 得x=(y+0.0997)/2.5689 解得:CMCase:x液体=0.463mg x固体=0.232mg FPA: x液体=0.281mg x固体=0.309mg因为酶活力= 则:CMCase:液体酶活力= 固体酶活力= FPA:液体酶活力= 固体酶活力=八、 结果分析 从实验整体看,实验还是成功的,不过还有不少方面存在问题:1. 由标准曲线中,R2=0.9715小于0.99,相关性较弱,可能在各种试剂配制不够准确以及实验操作不够规范。分析原因有:葡萄糖标准溶液定容操作出现失误,DNS的加入各个管存在误差,缓冲液配制不精确,测OD值实验操作不严谨。2. 为使固体发酵培养得菌种充分利用培养基需及时翻曲,能使其能在培养基的其他部位也长出菌落,提高酶产量。由于翻曲不充分,菌种只在培养基上部生长。3. 液体发酵培养时需在摇床上摇荡培养,菌体生长时能更有效率的利用营养物质,从培养结果看,菌种生长状况良好。1资料本