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1、蔗糖酶的提取及活力、含量和相对分子质量测定摘要：本学期共做了六次生化实验。.第一次是提取及纯化蔗糖酶，以为后续实验提供样品。实验主要目的是要求学生掌握高速离心机的使用。实验共得到不同纯化度的三种提取液，标记为A、B、C。将三种提取液分别放入冰箱保存，做为后续实验样品。也因此做此实验时必须保证各个操作无误，及准确，以免影响后续实验的结果。第二次是有关蔗糖酶的柱层析法，主要目的是要求同学掌握离子交换层析的原理及柱层析的操作技术及紫外吸收的分析方法。此次实验通过柱层析及紫外吸收法得到23管的活力最大的分离液合并为分离液D，放入冰箱作为后续实验样品。第三次实验为蔗糖酶的活力测定，目的为掌握酶的活力测定
2、方法，了解各个酶的纯化情况。利用分光度计测出各个样品的OD值，再对照葡萄糖的标准曲线来得出剩余葡萄糖的含量，从而获得各个酶的活力大小，了解各个酶的纯化情况。并得出结论酶的纯化度越高，活力越小。第四次实验为蔗糖酶蛋白质的含量测定，目的为掌握学习Folin-酚测定蛋白质含量的原理及方法，制备标准曲线测定未知样品中蛋白质含量。同样利用与标准曲线对照来得到试样的蛋白质含量，并测出酶的比活力。测量蛋白质的方法有多种，我们必须根据所做实验的具体选择合适的方法来测定蛋白质。第五次的实验是微量凯氏定氮测总蛋白。目的是要求同学掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理及方法。本实验除利用了凯氏定氮法外还加上了酸式滴定法
3、最后得出了毫克级别的总蛋白含量。其结果与上一实验所测得的总蛋白质含量有所不同，正证明了不同的方法测量蛋白质造成的误差不同，致所得结果不同。最后一次实验为SDS-PAGE测定蛋白质分子质量，目的为掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和测定蛋白质分子量技术。此实验操作复杂，需先制作凝胶再结果染色脱色，最后还要制作标准蛋白分子质量曲线图来进行试样对照。最后得到蔗糖酶的分子量在5万左右及9万左右。关键字：实验；提取液；比活；蛋白质；SDS-PAGE；OD正文：1， 蔗糖酶的提取及提纯1.1， 文献综述：蔗糖酶的分离利用的是细胞破壁法。细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取
4、胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。材料不同，破壁也方法不同。我们用的菌体（微生物）细胞破壁方法是：自溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用组织细胞自身的酶系将细胞破坏，是细胞内物质释放出来。自溶时需加少量防腐剂，以防外界细菌污染。 自溶法的缺点是时间较长。 本实验的自溶条件是：加乙酸钠保持弱碱性条件、35 、加入乙酸乙脂代替防腐剂，0.5-1h。自溶法的操作较简单方便，适合学生操作。（参考文献; 蔗糖酶的分离提纯及酶促）1.2， 材料与方法1.2.1，材料：啤酒酵母；醋酸钠；甲苯；4mol/L醋酸；95%乙醇；0.5mol/Lris-HCl P
5、H7.3缓冲液；锥形瓶；量筒；烧杯；具塞试管；吸球；培养箱；恒温水浴锅；磁力搅拌器；搅拌子；高速冷冻离心机；1.2.2，方法：1.2.2.1,酵母自溶：n 250毫升锥形瓶 ,加入20克鲜酵母n 加入醋酸钠1.6克，搅拌使团块的酵母液化n 加1.5毫升甲苯，包扎好瓶口，摇动10分钟，使充分混匀n 放入37培养箱，保温48-60小时，使酵母自溶1.2.2.2,初提液A制备.n 在培养箱中取出装有已自溶酵母的三角瓶，加10毫升蒸馏水，摇匀，倒入离心管1中，平衡（互加平衡）。n 用高速冷冻离心机4，15000rmin离心10min。n 离心管中的悬浮液分三层，上层为浆状物（甲苯及其抽提物)，下层为固
6、体（细胞碎片沉淀），中间一层为液体(含酶)。n 小心仔细地取出中间层的液体，重新倒入离心管2中，4，15000rmin离心10min （互加平衡）。n 取上清液倒入n 25毫升量筒 n 量体积记录VAn 取出3ml保存n 得初提液A1.2.2.3,热提取液B制备:n 将初提液A（VA-3ml）倒入50毫升的三角瓶中，加4mol/L的醋酸3.2ml左右，使溶液的pH值约为4.5左右，摇匀n 50恒温水浴中保温25min(注意温度绝对不能超过50)，在保温过程中不断的摇动三角瓶n 离心：4，15000rpm，10min n （H2O平衡）n 仔细地倒出上层清液入10ml量筒测量体积，记为VB，此提
7、取液为热提取液B。n 取出3ml于具塞试管保存，用于后续实验。1.2.2.4,乙醇沉淀提取液C制备n 将热提取液B （VB-3ml）倒入100ml的烧杯中，放入加有碎冰的大烧杯冰浴，置于磁力搅拌器上，缓慢加入体积（VB-3ml ）-20 95%乙醇。整个过程不少于25min，结束后再继续搅拌5minn 将烧杯内的液体全部移入离心管中，杯底白色固体保留待用，4，15000rpm,离心10min 加（ 95%2）乙醇平衡。离心后弃去上清液 n 用5毫升tris HCL溶解烧杯中的白色固体，再倒入离心管中搅拌使管内的固体溶解，再次离心， 4，15000rpm,10min,平衡用tris HCL溶液平
8、衡 n 离心后取上层清液入10ml量筒n 测量体积，记为VCn 此提取液为乙醇沉淀提取液Cn 测量其体积为VC。全部保存于具塞试管，用于后续实验。1.3,结果与讨论实验得到ABC各三种不同程度纯化的蔗糖酶提取液，颜色各从深及浅，说明蔗糖酶本身的颜色较浅。初提液A热提取液B乙醇沉淀提取液C溶液体系水溶液醋酸tris HCl特点pH值4.5左右pH值7.3左右体积/ml18.517.55.6颜色状态黄色溶液黄色溶液淡黄色溶液影响因素温度、酸碱度控制不准会影响蔗糖酶产量1.4,结论实验中在将提取液A水浴时必须不断摇动锥形瓶，温度不能超过50，取出后迅速在水浴中冷却，之后所有的操作都必须在冰浴上。而在
9、提取液B放入乙醇时，必须要保证乙醇的速度缓慢，是乙醇混合均匀，析出最大量的沉淀使所需酶充分变性沉淀。整个操作必须严谨细心，保证蔗糖酶得到了最优纯化。提纯酶时可以充分利用蛋白质的变性、复兴的性质来得到纯化的酶液。2,蔗糖酶的纯化Q Sepharose -柱层析法 2.1文献综述：通过对不同离子交换层析方法的比较 ,进行酵母蔗糖酶纯化实验改进 ,采用 Q Sepharose离子交换介质 ;流动相经 5 0 min由 0 .0 5 MTris- HCLp H7.3缓冲液到 1MNa CL的 0 .0 5 MTris- HCL p H7.3缓冲液 ,进行梯度洗脱分离 ,分离效果最好 ,蔗糖酶与杂蛋白得
10、到了有效的分离 ,回收率为 93.2 %,是现有实验的 3.17倍 ,浓缩倍数为 2 .91,是现有实验的 1.4 3倍 ,提高了实验效果。(参考文献; 离子交换层析纯化蔗糖酶实验方法改进研究)2.2,材料与方法2.2.1,材料n 试剂：0.05mol/LTris-HCl PH7.3缓冲液；1mol/LNaCl和0.05mol/LTris-HCl PH7.3缓冲液; 0.5mol/LnaOH; Q Sepharosen 器具：层析柱、梯度发生器及搅拌子、紫外分光光度计、点滴板等2.2,.2, 方法2.2.2.1,离子交换柱的填充n 固定和清洗：层析冲洗。下面留一点水。柱子垂直固定，下端的橡皮管
11、夹子夹紧、取下上部盖子，加水5毫升n 凝胶装柱：高约5公分，上面填平，注意上部水面高于交换剂平面，放松夹子，使水流下，直到与表面相切，夹紧夹子。2.2.2.2,缓冲液盐度梯度发生器的安装n 连通：先加入水，两个旋钮朝一个方向可以连通，使液体进入，连接桥不可以有气泡。然后使旋钮回到正中，加入相应的溶液。n 装入溶液：第一个杯子加入20毫升 0.05摩尔/升 Tris HCl pH 7.3 ，并加入磁力棒 ，第二个加入 20毫升 1摩尔/升 NaCl2.2.2.3,柱的平衡n 在小烧杯中加入15毫升Tris HCln 恒流泵进口插入烧杯液面下n 恒流泵出水管一端连接柱子n 放松夹子n 打开恒流泵n
12、 用Tris HCl冲洗n 直到缓冲液面与交换剂相切2.2.2.4,加样及洗穿透峰：n 夹紧下端夹子, 在烧杯加入15毫升Tris HCln 从上部缓慢加入0.5ml提取液C，放松夹子n 样品全部刚好进入交换剂内，相切，夹紧夹子n 先打开恒流泵，再放开夹子n 用量筒收集全部流出液体，每管收集3mln 直到液面相切2.2.2.5,氯离子梯度洗脱n 将梯度发生器出口与恒流泵相连n 恒流泵与柱相连n 打开搅拌器，打开连通器旋钮，打开恒流泵 n 用20 毫升Tris HCl 缓冲液配制的n 1摩尔/升 NaCl20 毫升溶液n 开始梯度洗脱 n 打开夹子n 用量筒收集3 毫升/管，n 直到全部缓冲液流
13、出2.2.2.6, 离子交换剂的再生n 烧杯加入15 毫升 NaCl洗脱 不用收集 凝胶冲到小烧杯 全部凝胶回收n 最后一个班用0. 5摩尔/升 NaOH洗3CV，除去氯离子，不用回收洗脱液最后凝胶回收，冲到烧杯里面2.2.2.7, 用紫外分光光度计测每管的紫外吸光度OD值，并记录。测定后样品回收!2.2.2.8, 酶活力测试n 样品选取（老师指导下）n 从洗穿透峰样品中选择1-2个蛋白质浓度较高的样品测定酶活力n 从梯度洗脱样品中选取峰值附近的几个样品进行酶活力测定。n 酶活力测定：点滴板中滴2滴5%蔗糖加2滴待测洗脱液玻璃棒搅匀放置5min浸入葡萄糖试纸1s（延长时间）取出过 60s比较颜
14、色深浅用“+”表示酶活力的大小 n 体积测定n 将酶活力较高的2-3个样品合并测量体积（洗穿透峰样品不用合并），记为VD，用具塞试管保留，其他样品可以洗掉。2.3,结果与讨论取酶活力最高的9、10、14合并为一管，记为提取液D。与实验一中获得的ABC一起放入冰箱中保存。初提液A热提取液B乙醇沉淀提取液C提取液D溶液体系水溶液醋酸tris HCltris HCl特点pH值4.5左右pH值7.3左右pH值7.3左右体积/ml18.517.55.65.4颜色状态黄色溶液黄色溶液淡黄色溶液无色溶液影响因素温度、酸碱度控制不准会影响蔗糖酶产量2.4，结论提取液C中除了高活性酶外，还有各种不同的杂蛋白质。
15、实验中应注意各种实验操作，在填充柱时要注意不要干柱，全部凝胶要回收归还。整个实验过程都要保证不要干柱。在安装缓冲液梯度发生器时，要注意打开后观察两个杯子中液体是否均有减少，连接桥不能有气泡。确保梯度浓度制成。3， 蔗糖酶活力的测定a) 3.1，文献综述: 在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系，可用于比色测定，可用DNS比色法测定还原糖的含量，可用DNS比色定糖法测定蔗糖 酶的活力.。（参考文献; 蔗糖酶的分离提纯及酶促）3.2，材料与方法3.2.1，材料n 试剂3、5-二硝基水杨酸；葡萄糖标准溶液0.2mg/ml； 0.2mol/L醋酸钠缓冲液，pH4.6； 5%蔗糖 用0.2mol/L醋酸钠缓冲液，pH4.6配置；2mol/L NaOH n 器材：电炉；恒温水浴锅；分光光度计；试管、移液管3.2.2，方法3.2.2.1，葡萄糖标准曲线制作n 烧水，不要太多n DN
