质粒DNA的提取鉴定

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1、实验三质粒DNA的提取鉴定、原理质粒是细胞质中独立于染色体之外的能自主复制的遗传单位。基因工程中的质粒一般是 指细菌质粒，它可以随着细菌的细胞分裂将自己的遗传特性稳定的遗传给后代细胞。广义的 质粒还包括霉菌、蓝藻和酵母质粒以及动植物细胞中的线粒体和质体等。细菌质粒是环状双 链DNA分子，其他少数质粒是线性DNA分子，而酵母的杀伤质粒则是RNA。环状质粒的 DNA分子具有超螺旋性质，长度可以从lkb到200kb左右不等。质粒中除了复制、转录等 相关的必需序列外，有一些DNA区段对于细菌来说并非必需序列，通过体外操作以目的基 因取代这些非必需区段，这种改造的质粒就成为外源基因载体。按照质粒载体的用

2、途和其外源 DNA 的遗传信息能否表达可分为中间克隆载体（如 PMD18-T）和表达载体（如pET-X、pBI121等）。克隆载体所连接的的DNA片段一般没有 启动子，因而不能转录，主要用于目的片段的大量制备。表达载体按照宿主的不同有各种各 样的原核表达载体（如大肠杆菌）和真核表达载体（如酵母、动物和植物），目的基因在载 体上有完整的启动子和终止子调控，可以在宿主细胞中转录并翻译成蛋白。T-Clonin根据质粒在宿主细胞中复制调控机制的不同，可分为两类：一类是“松驰型”质粒，如 pMBl/colEl复制子，其复制受到一种称为RNAII的分子正向调控，不需要任何质粒编码的 蛋白质，完全依赖于宿主

3、提供的寿命较长的酶和蛋白质，因此即使在氨基酸饥饿或添加氯霉 素等抗生素抑制蛋白质合成的条件下，其复制仍不停止，即所谓的“松驰”方式复制，其在 宿主细胞中拷贝数较多，一般如常用的pUC系列可达500700个；二是“严紧型”质粒， 如pSC101,其复制伴随着RepA蛋白的合成，因此一旦蛋白质合成受阻，其拷贝数就不能 增加，即在宿主的“严紧”控制下复制，其在宿主细胞中拷贝数通常仅有15个。在分子生 物学研究中，为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA，通常使用的是“松驰型”质粒；但在 某些特殊原因（如表达产物对细胞有毒性）下要求用严紧型质粒。H/nd IIISphlSse8387 IPstlHine I

4、IAcc 1Sa/1EcoR V XbaBamH Sma IXma IKpn ISac IEcoR 1图2质粒DNA图谱质粒DNA的分离提取主要有三个步骤：宿主细胞分离或快速繁殖。质粒DNA常以酵 母或细菌为宿主细胞。在一定培养条件下，酵母或细菌生长呈S形曲线，一般认为，处于对 数生长晚期的细菌细胞壁容易裂解，质粒DNA提取效率高。对于常用的pUC系列质粒，由 于其复制调控机制上的原因，细菌在37C或42C下培养，其拷贝数较多，30C时，拷贝数 会大大降低细胞的收集和裂解。通过低速离心可以将培养液中的菌体收集起来。收集的菌 体通过一定物理（如超生波）或化学方法（如强碱、变性剂）处理使细胞裂解，

5、从而可以将 胞内的质粒DNA释放出来。酵母细胞裂解比细菌要困难一些。质粒DNA的纯化。借助物理（如密度梯度离心）和化学（碱法）的方法将质粒DNA以外的细胞壁、染色体DNA、RNA 和蛋白质等杂质去除，可以获得纯的质粒 DNA。细菌裂解常利用去污剂（如SDS）和变性条件（如高温、强碱）使细菌细胞壁和细胞膜 裂解，释放出细胞内容物，溶菌酶预处理有助于提高细胞壁的裂解效果（作用于细胞壁肽聚 糖）。然后根据变性的染色体DNA和质粒DNA由于拓扑学特征的不同，造成的复性热力学 特征不同，将其分开。在碱性条件下，变性的染色体DNA和破裂的细胞壁、细菌蛋白等缠 绕成大型复合物，并被 SDS 包盖，复性缓慢，

6、当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从 溶液中沉淀出来，而闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开，当条件恢复 正常时，迅速复性，形成天然的超螺旋分子，因此可通过离心技术将两种类型的DNA分开。质粒 DNA 的纯化经典的方法有碱法和氯化铯-溴乙啶密度梯度离心。通过氯化铯-溴化 乙锭密度梯度离心直接将蛋白质、缺口环行或线性DNA、封闭环行质粒DNA和RNA分离 开来。碱法利用聚乙二醇（PEG）沉淀核酸，LiCL选择性沉淀去除大分子RNA，RNaseA 消解小分子RNA，再用苯酚、氯仿等蛋白变性剂结合离心将溶液中的残余蛋白质沉淀出去。 溶液状态的质粒 DNA 用有机沉淀剂（乙醇、异丙醇）

7、或结合无机沉淀剂（ NaAc、 NH4Ac 等）就可以沉淀出来。其他纯化方法还有电洗脱法、羟基磷灰石柱层析法， Sepharose2B 凝 胶过滤法等。影响质粒DNA产量的因素主要有寄主菌株遗传背景、质粒拷贝数和分子大小。大肠杆菌质粒DNA分子自然状态下是共价闭合环状DNA（cccDNA）。但在DNA提取 过程中，由于细菌正处于对数生长期，加之提取过程是在剧烈裂解条件下进行，提取到的 DNA一般可能包括以下几种构型：超螺旋（scDNA，复制完成）、套索DNA（复制进行中）、 开环DNA （ocDNA）、线性（LDNA）等，在琼脂糖电泳中由于泳动速率不同可以观察到多 条电泳谱带，谱带的先后顺序、

8、相对距离主要决定于构型（ scDNALDNA ocDNA 套索 DNA），同时还受操作过程和凝胶中溴乙锭浓度的影响。二、材料、仪器和试剂1材料大肠杆菌DH5a （含质粒pUC）2仪器三角瓶、离心机（离心管）、量筒或移液管、微量移液器、天平、电泳装置3试剂LB培养基lOOOmL酵母粉5g胰蛋白胨10gNaCl10g调节pH值为7.05 X磷酸母液100mlKH PO2411.56gK2HPO .3H 03282.19glM Tris.HCL (pH8.0)100ml12.1gTris 碱水 80ml用浓HCL调pH,HCL用量为pH=7.47ml7.66ml8.04.2ml(应使加入HCL后的溶

9、液冷却至室温再最后调准PH值)0.5M EDTA (pH8.0) 100mlNa2 EDTA:18.61g水 80 ml用NaOH (约20g)调PH = 8.0，定容后高压灭菌。10% SDS 100mlNa-SDS10g水800ml68C搅拌溶解，定容100ml,用HCL调pH=7.21 号溶液 100ml葡萄糖(Glucose)0.9g1M Tris-HCL(pH8.0)2.5ml0.5M EDTA(pH8.0)2.0ml咼压灭菌后置于4C保存。2 号溶液 100ml10N NaOH2ml10% SDS10ml用前配制，但提前配好10N的NaOH母液及10%SDS母液。5M KAC（pH

10、5.2）100mlKAC49.07g先用少量水溶解，再用冰醋酸调pH=5.2,定容100ml3号溶液（3M醋酸钾pH5.5）100ml醋酸钾（5M）60ml冰乙酸11.5ml定容为100m l,保存于-20C的冰箱内。5M LiCl 100mlLiCl H2O30.25g定容至100ml后，高压灭菌，储存于-20CoSTET 100mlNaCL0.6g1MTris.Cl (pH 8.0)1ml0.5MEDTA(pH 8.0)0.5mlTriton5 mlTE 缓冲液（pH8.0） 100ml1MTris.Cl （pH 8.0）1ml0.5MEDTA（pH 8.0）0.5ml灭菌保存，备用。RN

11、A 酶处理RNA酶溶于10mM Tris （pH7.5）、15Mm NaCl溶液，使酶浓度为10mg/ml,沸水煮1520分钟，慢慢冷却至室温，分装后于-20C保存。1.6M NaCl（含 13%PEG）100mlNaCL9.35gPEG16.28g10M NHAc 100ml4NH4AC77.08g定容100ml,过滤灭菌室温保存（低于23C结晶！）0.01M NaAc（pH5.2） 1000mlNaAc.3H2O1.36g水800ml用冰醋酸调pH=5.2，定容。三、操作步骤方法一大肠杆菌质粒DNA的大量提取（碱法）1 将含有质粒的大肠杆菌在LB液体培养基（含适量抗生素）中37C培养16-

12、20小时。2. 用含抗生素的LB培养基繁殖大肠杆菌37C, 250rpm，震荡培养16小时左右。3. 悬浮菌液移至大离心管内，每管500ml, 4C下6000rpm离心15分钟，弃上清。4用“1号溶液”（18ml/管）回溶菌块（摇床上慢摇10分钟），确保菌块全部回溶。5 .加2ml浓度为10mg/ml的溶菌酶（溶在1号溶液内），室温下放置10分钟。6. 加40ml冷的“2号溶液”混匀，室温下放置10分钟（此时菌液应变清）。7. 每管加 20ml 冷的“3 号溶液”，充分混匀（不再分两个液相），在冰内放置 10 分钟， 并摇动混合 3 次， （此时细菌的染色质应沉淀下来）。8. 4C下9000r

13、pm，离心15分钟。如染色体DNA未完全沉淀，重复离心，直至大分子 DNA沉淀全部清除为止。9. 取上清，加 0.6体积的异丙醇，混合后置室温下10分钟。10. 室温下8000rpm离心15分钟（不要4C离心，否则盐会沉淀！）。取沉淀用70%乙醇 洗二次，倒置离心管干燥。11. DNA回溶在TE内（每500ml菌液加3ml），混合后室温下30分钟（此步可停）。12. 将溶解后的提取物移至15-30ml的离心管内，加等体积（3 ml）冷的5M LiCl，混合后置冰上2-5分钟。4C下10000rpm离心 10分钟（沉淀大分子RNA）。13. 将上清移至干净的离心管内（30-50ml的离心管），加

14、等体积的异丙醇，混合均匀，室 温下沉淀5-10分钟（摇两次）。室温下以10000rpm离心10分钟。14. 倒掉上清，倒置离心管以除去残余的上清。用 70%乙醇洗2次（室温），倒置离心管 干燥几分钟蒸发乙醇。15. 沉淀溶于500山的TE,加RNA酶A （终浓度为20yg/ml）,将混合液移至1.5ml的小离心管内，室温下置 30 分钟。16. 加500卩1的1.6M NaCl（含13%的PEG8000）,混合均匀。置冰上2-5分钟，于4C下 12000rpm离心5分钟（回收质粒DNA）。小心倒掉上清，将沉淀溶于400卩1的TE中（此 步可省略！）。17. 用等体积的苯酚/氯仿异戊醇（25:2

15、4:1y/v）抽提1次，取上清液，再用等体积的氯仿:异 戊醇（24:1）抽提一次。18. 将上层液小心吸出，置于干净的1.5mL离心管内。加100卩1的10MNH4Ac溶液，混 合。再加2倍体积（约1ml）的无水乙醇，室温下置10分钟。19. 于室温下 12000rpm 离心 5 分钟。20. 小心吸去上清。加200山的70%乙醇（4C）,振荡几秒钟后，室温下12000rpm离心 5分钟。重复一次，倒置离心管使乙醇蒸发（勿倒掉DNA沉淀！）。21. 将沉淀溶于500山的TE。取少量用TE稀释50-1000倍，测OD26o，算出质粒DNA 的浓度（1OD26（=50pg质粒DNA/mL）。保存于-20 C内待用。方法二 大肠杆菌质粒DNA的微量提取（煮沸法）1. 将含有质粒的大肠杆菌（农杆菌）接种于含抗生素适量LB（ YEP）培养基中，7C（28C），200rpm 震荡培养至对数生长期。2. 取1ml菌液至1.5ml的离心管中，12000rpm，离心1分钟。3. 去上清，用80卩l STET