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1、绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达张历涵 2013141241098彭千 2013141241068一、质粒转化入感受态细胞并培养1、 原理实验室提供的质粒首先要转入大肠杆菌进行培养与增殖，制备出感受态的细 胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段 中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源 DNA 而不将其降解的生理状态。感 受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体 DNA 的 结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的 DNA 分 子的受体位点等。本实验为了
2、把外源DNA (重组质粒)引入大肠杆菌，就必须先 制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。2、 实验步骤2.1 DH-5a 和BL-21感受态细胞的制备(1) 将04 C保存的DH-5a和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37 C 下 250 r/min 过夜培养 16 h 。(2) 将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37 C活化培养23 h至OD=0.30.5 。(3) 取1.5 mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min,然后于4 C下5000 r/min 离心5 min。弃上清液，沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCI2缓和悬菌。
3、冰上 放置 15-30 min 后，4 C下 5000 r/min 离心 10 min。(4) 弃上清液，沉淀用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2 (含15%甘油)缓和悬菌， 放在一20 C冰箱内保存。2.2 感受态细胞的转化(1) 取制备好的感受态细胞100卩l，冰上解冻，均匀悬浮。(2) 加入2卩l酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。(3) 42 C水浴中热击70 sec后，冰上放置2 min。(4) 加入200卩l LB液体培养基，37 C，50-100 rpm振荡培养1 h。(5) 取200 p l悬浮细胞涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上，用涂布器 均匀涂
4、布，平皿正放静置1-2 h后，封口膜封好平皿，37 C培养倒置12-16 h。二、质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测1、 原理：首先选择好将绿色荧光蛋白导入大肠杆菌的载体，一般选用pET-28a质粒， 因为该质粒具有多酶切割位点，并且导入外源基因后可以充分表达。已知 PEGFP-N3质粒上携带表达绿色荧光蛋白的基因，此基因作为目的基因pET-28a 质粒作为载体进行重组前需要先提取并检测。使用碱裂解法提取质粒， 用到 3 种溶液， 溶液 I： 50 mM 葡萄 糖、25 mM Tris-Cl、10 mM EDTA, pH 8.0；溶液 II： 0.2 N NaOH、1% SDS； 溶液III :
5、3 M醋酸钾、2 M醋酸。选用适当浓度和适当pH值的Tris-Cl溶液来 调节溶液ph。加入的葡萄糖可以使悬浮后的菌不会快速沉积到管子底部。EDTA 是 Ca2+ 和 Mg2+ 等二价金属离子的螯合剂，可以抑制 DNase 的活性和微生物生 长。此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。溶液 II 中 NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂，会使细胞膜从双层膜向微囊结构的相变化， SDS 为下一步做铺垫。溶液 III 的作用 SDS 在高盐浓度下发生沉淀，同时 SDS 能与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个 SDS 分子，所以沉淀也将溶液中 的大部分蛋白质沉淀下来。溶液中的K+置换
6、了 SDS中的Na+而形成了不溶性的 PDS,高浓度的盐使沉淀更完全。同时，由于基因组DNA很长，容易被PDS共 沉淀。2 M的醋酸可以中和NaOH,因为长时间的碱性条件会打断DNA。基因 组DNA 一旦发生断裂，小于100 kb的片断，就不容易与PDS共沉淀。所以碱 处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组 DNA污染。这一步操作混合均匀后在冰上放置，可以使PDS沉淀更充分。在 pH 为 8.0-8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带 负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的琼脂糖凝胶介质作为电泳支持物， 在分子筛作用下，事分子大小和构象不
7、同的核酸分子涌动率出现较大的差异，从 而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料(如溴化乙锭) 后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。在质粒提取的过程中，由于操作 原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA、闭环超螺旋DNA。当 提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋线状开环。2、 实验步骤2.1将目的基因质粒的大菌种接种在液体培养基中(相应浓度抗生素)，37C培 养过夜。2.2 收集菌体将扩增的菌体收集1.5mlEP管中。每次4C， 12000r/min离心2min，弃上清液后 重复一次，弃上清液。2.3 裂解菌体(1) 将菌体沉淀重悬于100
8、卩l用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡10min.(2) 加200l新配制的溶液II,盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内溶 物，不可强烈振荡，放置冰上5min左右。(3) 加150l用冰预冷的溶液III，盖紧管口，将管倒置后温和地振荡10s，使 溶液III在粘稠的细菌裂解物分散均匀，置冰上15min。(4) 4C、10000r/min离心5min,将上清液转移到另一离心管中，并定量上清 液的体积。2.4 提取质粒 DNA(1) 加等体积酚：氯仿( 1： 1)，于上清夜中，振荡混合， 4C、 10000r/min， 离心10mi n,将上清液转移到另一离心管中，冰定量上清液的体积。(2) 加2倍体
9、积的无水乙醇和0.1体积的3mol/L NaAc,室温下沉淀质粒DNA, 振荡混合，放置 30min。(3) 4C、12000r/min离心30min。小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾 上，以使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除尽。(4) 用冰冷的1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀2次(每次用),不要搅起沉淀，弃上清、倒置于滤纸上，使沉淀干燥。5001(5) 保存质粒取适量TE缓冲液溶解质粒DNA，混匀后-20C保存备用。2.5 DNA琼脂糖凝胶电泳的检测(1) 装好制胶装置用胶带将洗净、干燥的制胶板两端封好 (一定封严，不能留;. 缝隙),使用水平仪，将胶板调至水平，插入适当梳子。(2
10、) 将1g琼脂糖加入30ml 1XTAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至 琼脂糖完全溶解(冷却到60C，加入1p l的Goldview，并摇匀)，则为1%琼脂 糖凝胶液。(3) 将溶解的琼脂糖(约50C )倒入，室温冷却凝固。(4) 充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽 中(注意：DNA样品孔应朝向负电极一端)，加1XTAE电泳缓冲液至液面覆盖凝 胶 1mm。(5) 用移液器吸取质粒样品5p l于封口膜上，再加入1l的6X加样缓冲液, 混匀后，小心加入点样孔。( 6 )打开电源开关，调节电压至1 00V ，可见蓝条带由负极向正极移动。(7) 当蓝条带移动到距凝胶
11、前沿12cm处，停止电泳(8) 将凝胶置于紫外线透射仪上，打开紫外灯，DNA存在处显出荧光条带。三、PCR、酶切等方法获取目的基因，酶切连接重组质粒1 、原理PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物， 经酶促合成特异的DNA片段的体外方法。反应过程由高温变性，低温退火和适 温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA得以迅速扩增。 置待扩增DNA于高温下解链成为单链DNA模板，人工合成的两个寡核苷酸引 物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72C将 单核苷酸从引物3端开始掺入，沿模板53方向延伸，合成DNA新链。目的基因与载体扩
12、增后要进行重组，利用共有的酶切位点即Bam Hl和Not I 两个位点进行双酶切，产生相同的粘性末端便于在DNA连接酶的作用下重新连 接。2、实验步骤2.1 PCR 实验(1) 在0.2ml EP管内配置PCR反应体系一个。(2) 混匀后瞬时离心。(3) 放入PCR仪中，设置反应程序。2.2 酶切实验(1) 分别取两支0.2ml EP管做好标记。(2) 两个EP管中分别配置两个体系即各加入一种质粒和两种限制性内切酶。(3) 将两支EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱37C酶切1h。(4) 可取 5 l 进行电泳检测。2.3 DNA的连接重组(1) 在EP管中加入缓冲液，酶切后的载体质粒和荧光蛋
13、白质粒以及DNA连接 酶。(2) EP管中液体混匀后瞬时离心，放入培养箱22C反应20min，-20C下保存 用于转化。四、重组质粒导入DH5 a扩增1、原理重组质粒虽已构建完毕，但是为得到大量的重组质粒，需要将重组质粒导入 到DH5a中进行扩增。为了将重组质粒导入细菌中，我们首先得使得细菌处于易 于吸收外源DNA得感受态。其原理是细菌处于0C，在有CaCI2存在的低渗溶液 中，菌细胞便会膨胀成球形，易于吸收外源DNA。再加之转化混合物中的DNA 形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42C短时间热击处理, 促进细胞吸收DNA复合物。在将重组质粒导入细菌之后，就需要将细菌置于非选
14、择性培养基上培养一段 时间，促使在转化过程中获得的新的表型得到表达。然后，再将培养的到的细胞 转接到含有Kana的LB固体培养基上，便可以鉴定和筛选出重组子。2、实验步骤(1) 取出感受态细胞DH5a让其在冰上自然解冻，每200山解冻的感受态细胞 加入整管连接产物，混匀后冰浴30 min。(2) 42C热冲击90秒，立即置于冰浴5min。(3) 再在感受态细胞混合物中加入0.8ml的LB培养基，于37C的摇床中培养 1h。(4) 1h后，6000r/min离心3min，去掉上清液(约留200山的培养液)，摇匀菌 快。(5) 用玻璃涂布器将溶液均匀地涂布在含 Kana 的 LB 固体培养基上，正
15、置培养 皿半小时后，37C倒置培养皿过夜。( 6)第二天早晨，观察实验结果。五、菌落 PCR 鉴定阳性克隆1、原理菌落PCR可不必提取目的基因DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解 后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。在实验过程中，我们特意使用 载体上的通用引物来筛选阳性克隆。2、实验步骤(1 )在0.2ml的EP管内配制25MPCR反应体系一个：18.5ylddH2O, 2.5|J10*Buffer，1.5|JMgCl2, 1|J4*dNTP，0.5山的引物 1，0.5山的引物 2，0.5山 的Taq酶，挑菌落一个。(2) 用灭菌枪头挑单菌落接触EP管内，混匀瞬时离心。(3) 放入PCR仪中，设置反应程序：94C预变性5min；94C变性30s； 55C退火30s:72C延伸60s；重复彳。次；72C延伸10min。(4) 取9山反应液加1yl10*Loading Buffer做电泳检测。六、pET-28a-EGFP 的表达1、原理于重组质粒导入DH5a扩增步骤的原理相同，首先得到感受态细胞，然后将 pET-28a-EGFP质粒导入其中，在培养基上培养，使其表达。2、实验步骤(1) 取出感受态细胞BL21,让其在冰上自由解冻，5ylpET-28a-EGFP质粒加 入200山解冻的感受态细胞中，轻弹混匀后冰浴30
