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1、简介作用原理:聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式:非变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)及SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE);非变性聚丙烯酰胺凝 胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的 形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由 shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原 剂(SDS即十二烷基硫酸钠)后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小(可 以忽略电荷因素)。二作用SDS是阴离子
2、去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使 分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半 胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链， 解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的 电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS-PAGE 一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨 率。浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上, 经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选T
3、RIS/HCI 缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCI解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘 氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最 慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而 电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动, 形成一稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子 形状无关。三补充信息聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为 PAGE(Polyacrylamide gel electrophore
4、sis)聚丙烯酰氨凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯 酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化 聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以 四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后 者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形 成三维网状结构PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系 中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连 续系统
5、中由于缓冲液离子成分，pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中 泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均 较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合 而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCI。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶， 凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCI。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、 2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连 续性，这是样品浓缩的主要因素。四.过程蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率
6、取决于它所带净电荷以及分子的大小 和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小， 就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基 硫酸钠(SDS)具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，可使蛋白质 分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同 密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原 有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质-SDS复合物形成近似 雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，
7、约为18A(1A=10的 负十次方米)，这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和 形状的影响，而取决于分子量的大小由于蛋白质-SDS复合物在单位长度上带有相等的电 荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的 分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快;大分子蛋白 质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而 被分离。因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。当分子量在15KD 到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式:logMW=
8、K-bX, 式中:MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率 对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的 电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在 SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成 分别对应于各个亚基的几条带。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要 不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于 了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。五常见问题1.配胶缓
9、冲液系统对电泳的影响？在SDS-PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统，浓缩胶是 pH6.7,分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环 境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低;而CL离子却很高， 两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度 成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄 的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率 增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白
10、分子根 据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很 好解决问题的情况，应首要考虑该因素，当然其他的因素也可以从多方面考虑。2. 样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法:还原SDS处理、非还原SDS处理、带 有烷基化作用的还原SDS处理。1）还原SDS处理:在上样buffer中加入SDS和DTT（或作巯基乙醇）后，蛋白质构象被 解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一 般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5mi n,再 离心加样。2
11、）带有烷基化作用的还原SDS处理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的 保护SH基团，得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。 100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。3）非还原SDS处理:生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min, 未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳 成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液:浓缩胶选择pH6.8，分离胶选择pH8.
12、8,选择Tris-HCl系统，TEMED与 AP:AP催化剂，催化单丙和双丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED四甲基乙二胺，催凝剂，加 速AP催化作用;十二烷基磺酸钠（SDS）:阴离子去污剂，作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白 质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法:待凝胶在室温凝固后，可在 室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可 导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又
13、各自不同的染色方 法，具体可参照郭尧君编著的蛋白质电泳技术手册P82-103。5微笑（两边翘起中间凹下）形带原因？主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法:待其充分凝固再作后续实验。6皱眉（两边向下中间鼓起）形带原因？主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 处理办法:可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。7.为什么带出现拖尾现象？主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。此外可能是灌胶时分离胶过多导 致浓缩胶很少，不能起到浓缩作用，没有把样品压成一条线。处理办法:加样前离心;选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间
14、过 长，重新配制;降低凝胶浓度;灌胶时分离胶不要过多。8为什么带出现纹理现象？主要是样品不溶性颗粒引起的。处理办法:加样前离心;加适量样品促溶剂。9什么是鬼带”，如何处理？鬼带就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶 中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而 失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子， 其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性, 在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法:在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，
15、以补充不足的还原剂; 或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓 冲液和分离胶的浓度有关。处理办法:更换正确pH值的Buffer;降低分离胶的浓度。11. 为什么电泳的条带很粗？电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法:适当增加浓缩胶的长度;保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）;适当降低电压；12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于 电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括a内外槽装反;b 外槽
16、液过少;c.电泳槽底部的 绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。处理办法:电泳槽正确装配即可。13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力 不均匀或过猛所致;后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。14凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。 APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是APS和 TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。15.电泳时间比正常要长？可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误,即缓冲系统地PH和被分离物 质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。16分离胶
