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1、成年饲料鸡肠道正常菌群的检测 本科生毕业论文(设计)题 目： 成年饲料鸡肠道 正常菌群的检测 学生姓名： xx 学 号： xx 专业班级： 生物科学10103班 指导教师： xx老师 完成时间： 2014年5月1日 目 录1 引言42 材料和方法52.1 实验材料52.1.1 实验动物52.1.2 实验菌株52.1.3 实验试剂与药品52.1.4 实验器材52.2 实验方法52.2.1培养基的配方52.2.2配制培养基62.2.3 菌体分离与纯化72.2.4 革兰氏染色72.2.5 菌株筛选82.2.5.1产蛋白酶菌株的筛选82.2.5.2产脂肪酶菌株的筛选82.2.5.3产淀粉酶菌株的筛选9
2、2.2.5.4产纤维素酶菌株的筛选93结果与分析103.1 菌种分离纯化与革兰氏染色103.2 产蛋白酶菌株的筛选123.3 产脂肪酶菌株的筛选143.4 产纤维素酶菌株的刷选163.5 产淀粉酶菌株的筛选174 讨论与小结195 参考文献216 致谢22成年饲料鸡肠道正常菌群的检测 生物科学专业：xx 指导老师：xx摘要：从健康的成年饲料鸡肠道前段、中段、后段分离细菌30株。革兰氏染色结果表明：24株为革兰氏阴性菌，6株为革兰氏阳性菌。研究了他们产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶的能力。结果表明：本次实验从健康的成年饲料鸡肠道分离得到的30株菌中，21株都产蛋白酶，占菌株总数的75%，产脂肪
3、酶的有18株，占总数的60% ，产淀粉酶的有12株，占总数的40%，产纤维素酶的有9株，占总数的30%。其中产4种酶的有1株，产3种酶的有8株，产2中酶的有13株。产一种酶的有6株。关键词：鸡肠道，蛋白酶，脂肪酶，纤维素酶，淀粉酶Adult chicken feed detection of intestinal normal flora Student :Liu Hengjia Advisor:Li NaAbstract：From healthy adult chicken feed front, middle, after a period of separation of intesti
4、nal bacteria 30 strains.Gram staining results showed that 24 strains of gram-negative bacteria, 6 strains of gram-positive bacteria.They produce protease, amylase, lipase and cellulase.Results show that this experiment from the healthy adult in intestinal 30 strains of bacteria were isolated from fe
5、ed chicken, 21 strains producing protease, accounting for 75% of the total number of strains, there are 18 strains of lipase production, accounting for 60% of the total, there were 12 strains produce amylase, accounting for 40% of the total, produce cellulase has 9 strains, 30% of the total.Among th
6、em one of four kinds of enzyme production, eight strains of the three kinds of enzyme production, have 13 of 2 enzyme production.To produce an enzyme has 6strains.Keywords:Chicken intestine,protease,lipase, cellulase ,amylase1 引言 鸡(Chicken)属鸡形目雉科原鸡属红原鸡亚属。鸡是人类饲养最普遍的家禽。家鸡源出于野生的原鸡，其驯化历史至少约4000年，但直到1800
7、年前后鸡肉和鸡蛋才成为大量生产的商品。鸡的种类有火鸡、乌鸡、野鸡等。鸡的种类很多，各地所产的鸡，大小形色都不相同。 鸡的体温在40.9与41.9之间，平均体温是41.5。雏鸡在养殖时舍温要求比较高，一般在35左右。一只母鸡年平均产蛋300枚左右，平均出雏率在70%以上。鸡的一般最长存活13年。每100g可食部分含能量167cal，蛋白质19.3g，脂肪9.4g，水69g，碳水化合物1.3g，维生素A48mg，维生素B0.05g，维生素B0.09g，维生素E0.67mg，烟酸5.6mg，钠63.3mg，钙9mg，铁1.4mg，胆固醇106mg。鸡食性简单，食料来源广，且生长迅速，产量高，是人类饲
8、养最普遍的家禽。随着鸡养殖大幅度提高，其病害发生也日趋严重，各种病原体的侵袭严重影响了鸡的产量和效益。而在家禽动物疾病防治过程中，抗生素类的药物作用明显，但是它们可导致耐药性的产生以及耐药因子的传递，残留的药物会通过食物链影响人类的健康等，所以寻求抗生素替代品就愈加重要，益生菌的出现给人们带来了新的希望。 鸡消化道不同部位在营养物质的消化、吸收和肠道健康中发挥着不同的作用。嗉囊、肌胃和十二指肠的主要功能是消化饲料,空肠和回肠的主要功能是吸收营养物质,盲肠内容物经过大量微生物的发酵,进一步吸收营养成分,去除毒性物质,减少有害微生物数量。鸡消化道中的大量微生物菌群对其营养、免疫、疾病防治以及生理功
9、能的发挥都要产生重要影响,进而影响鸡的生长和健康。正常情况下,动物消化道内存在的有益微生物对维持消化道内的菌群平衡、促进动物生长和饲料的消化与吸收起着重要作用。当环境及饲料投放等过激时会造成动物机体消化道内微生物区系紊乱。病原菌大量繁殖，引起动物消化机能失调，生长受阻。本研究旨在研究健康饲料鸡肠道中分离到的几种可以产蛋白酶菌株、纤维素酶菌株、淀粉酶菌株和产脂肪酶的菌株及其分布状况，以期为后续研究工作打下基础。2 材料和方法2.1 实验材料2.1.1 实验动物 饲料喂养的健康鸡个体（数只）2.1.2 实验菌株 大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌等。2.1.3 实验试剂与药品 硫酸镁、牛肉膏、氯化
10、钠、磷酸氢二钾、吐温80、中性红水溶液、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂、酪蛋白、磷酸氢二钠、0.4%溴麝香草酚蓝溶液、氯化钙、吐温-80、蒸馏水等。2.1.4 实验器材 高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温干燥箱、冰箱、生物显微镜、电子天平、移液管、胶头滴管、培养皿100、微生物实验常规用具等。2.2 实验方法2.2.1培养基的配方 FWA培养基：硫酸镁0.05g，牛肉膏2.50g，氯化钠5.00g，磷酸氢二钾0.20g，葡萄糖1.00g，蛋白胨5.00g，酵母膏2.50g，琼脂15.00g，蒸馏水1000ml，pH为7.2-7.4 测定菌株产蛋白酶的培养基：酪蛋白10.00g，磷酸氢二
11、钠2.00g，琼脂13.00g，蒸馏水1000ml，0.4%溴麝香草酚蓝溶液12.5ml，pH为7.2-7.4 测定菌株产脂肪酶的培养基：蛋白胨5.00g，酵母粉1.00g，氯化钙0.10g，吐温-80为10ml，氯化钠5.00g，琼脂15.00g，蒸馏水1000ml，pH为7.2 测定菌株产纤维素酶的培养基：蛋白胨10.00g，琼脂10.00g，氯化钠2.50g，胆盐2.50g,乳糖5.00g，1%中性红水溶液2.50g，蒸馏水500ml,pH为7.2测定菌株产淀粉酶的培养基：牛肉膏5.00g，蛋白胨10.00g，琼脂10.00g，氯化钠5.00g，淀粉5.00g，pH为7.0-7.22.2
12、.2配制培养基（1）称药品：将实验所需药品放在滤纸上用电子天平称量，称取后溶解于蒸馏水中倒入大瓷缸。（2）加热溶解：在大瓷缸中加入所需水量，然后放在电炉上，小火加热，加热时在瓷缸底部垫石棉网使瓷缸受热均匀。边加热边用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充蒸馏水至1L。（3） 调pH值：用玻璃棒从瓷缸中沾取一滴待测滴液涂在pH试纸上，再与比色卡上的颜色对比，若发现瓷缸中的pH值偏碱，用1mol/L的HCl调至所需pH值范围，若发现瓷缸中的pH值偏酸，用1mol/L的NaOH调至所需pH值范围。（4） 分装：将配置的培养基分装在三角瓶内和试管中，分装时应该避免培养基粘在瓶口而造成污染，且分装量不应该超
13、过三角瓶的2/3.试管中的培养基要适量，不超过试管的2/3适宜。（5） 加棉塞：棉塞的形状、大小和松紧度要适中，不留缝隙，以防被细菌污染和保持有效的通气。（6） 包扎：棉塞外包上报纸，纸外用棉绳捆好，防止灭菌时冷凝水沾湿棉塞。（7） 灭菌：采用的是高压蒸汽灭菌，将带灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，放好垫子，将盖子上与排气孔相连接的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口。以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓，关上排气阀后接通电源，开始加热。当压力表的指针上升到0.05MPa时，打开排气阀排出锅内冷空气，待压力表指针回到0MPa附近时，关上排气阀，重复上述排冷空气
14、的操作一次，此时锅内的冷空气一般已经排尽，关上排气阀，当压力表指针上升到0.1MPa时开始计时，使指针维持在0.1MPa到0.15MPa之间的时间为30分钟，最后切断电源，使灭菌锅自然冷却，待压力表指针回到0MPa附近时打开排气阀，拧开盖上的螺栓，将锅盖打开小半，利用锅内的蒸汽将包扎的报纸烘干。之后取出灭菌物品，放入超净工作台。注：灭菌过程要注意安全，加水要适量，气垫要放正，防止漏气，注意勿烫伤手。灭菌后的物品不能将棉塞上的报纸打开，避免外界细菌进入污染培养基和蒸馏水。试管取出后应该斜放，斜面长度达约为试管长度的1/2。（8） 无菌检查：将灭菌的培养基放入37恒温箱中培养48小时，然后取出观察
15、，培养基上没有细菌生长，说明培养基灭菌效果良好，符合实验要求。然后将培养基贮存于冰箱的上层，温度控制在4.注：不能将棉塞上的牛皮纸打开，避免细菌进入污染培养基。2.2.3 菌体分离与纯化(1) 取鸡的肠道，将鸡肠道内的粪便等物清除干净。用手术剪刀不断剪切肠体，用研磨棒将肠研磨成糊状直至没有明显的块状。于电子秤上准确称取1g肠体放入装有9ml无菌水的试管中震荡，使肠体与无菌水完全混匀，制成原液10。然后在无菌操作台中用灭菌过的1ml吸管吸取1ml原液滴入装有9ml无菌水的试管中混匀进行10倍系列稀释，稀释至10。在无菌操作台中取其中10、10、10 3个适宜浓度梯度的菌悬液各0.1ml于FWA平板上涂匀，每个浓度梯度涂布3个平板，将涂好的平板于40下培养48h至菌落长出。(2) 在FWA平板上挑取菌落特征不同的菌落作稀释划线培养，并在相应的平板上标号112号，于4
