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1、pro （蛋白质）的测定方法分为两大类：一类是利用pro的共性，即 含氮量，肽链和折射率测定pro含量，另一类是利用蛋白质中特定氨 基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定pro含量。但是食品种类很 多，食品中 pro 含量又不同，特别是其他成分，如碳水化合物，脂肪 和维生素的干扰成分很多，因此pro的测定通常利用经典的剀氏定氮 法是由样品消化成铵盐蒸馏，用标准酸液吸收，用标准酸或碱液滴定， 由样品中含氮量计算出pro的含量。由于食品中pro含量不同又分为 凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。 一 凯氏定氮法这种方法是1883年Kjeldahl发明，当时凯氏只使用H2SO
2、4来分解 试样，来定量谷物中的pro，他只知用H2SO4分解试样，而不能阐明 H2SO4 分解有机氮化合物生成氨的反应历程，所以只使用 H2SO4 分 解试样，需要较长时间，后来由Gunning加入改进，他改进的办法是 在消化时加入K2SO4使沸点上升，这样加快分解速度，因为温度由原 来硫酸沸点的380上升到400，提高了不到67C所以速度也就加快 了，凯氏定氮法至今仍在使用。我们在检验食品中pro时，往往只限于测定总氮量，然后乘以pro核 算等数，得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶 啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗pro。1 凯氏常量定氮法：不论常量、半微量以及微量
3、定氮法它们的原理都是一样的，首先第一 个步骤是消化：1）消化：样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机物脱水。并破坏有机物，使有机物中的 C、H 氧化为 CO2 和 H2O 蒸汽逸出，而 pro则分解氮，则与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中。（2）在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330C，而添加硫酸钾后，温度可达4O0C,加速了整个反应过程。此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类来提高沸点。其理由随着消化 过程硫酸的不断地被分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点 增加。加速了有机的分解。但硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高
4、， 生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。为了加速反应过程，还加入硫酸铜，氧化汞或硒粉作为催化剂以及加 入少量过氧化氢，次氯酸钾作为氧化剂。但为了防止污染通常使用硫 酸铜。所以有机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，它具有催化功能，还可以作为碱性反应指示剂。1）蒸馏：样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要防止样液中氨气逸出。2）吸收与滴定：蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行 氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液从而计算出总氮量。半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸直接滴定，酸呈微弱酸性，用
5、酸滴定不影响指示剂变色反应，它有吸收氨的作 用。1操作步骤：准确称取样品中050-20Ogf于500ml凯氏瓶中加10g无水K2SO4f加05gCuSO4f加20ml H2SO4-在通风橱中先以小火加热，待24424泡沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后，将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中f继续消化30分钟-至到样液呈绿色状态，停止 消化，冷却f加200ml水一连接蒸馏装置f用硼酸作吸收液f在K 氏瓶中加波动珠数粒和80ml50% NaOHf立即接好定氮球f加热f至到K氏瓶内残液减少到三分之一时，取出用水冲洗f用0.1N HCl滴定。计算：总氮量= N（V2-V1）X 0.014） /W X
6、 1000.014氮的毫克当量数pro%=总氮 %XK乳制品 K=6.38（N=15.7%）小麦粉 K=5.79（N=17.6%）动物胶 K=5.6（N=18.0%）冰蛋 K=6.7（N=14.8%）大豆制品 K=6.0 （16.7%） K=6.25 则（N=16%）K-换称等数各种试剂的作用:浓 H2SO4：A ：脱水使有机物炭化，然后有机物炭化生成碳，碳将 H2SO4 还原为SO2,本身则变为CO2B： 氧化C： pro 与浓 H2SO4 生成 NH3 t, CO2, S02, H2O tD： NH3与H2SO4生成硫酸铵（1） CuSO4的作用（催化剂）CuSO4为红色沉淀，当C完全消化
7、后，反应停止，红色消失，变为兰色，即为消化达到完全，兰色为CuS04的颜色(2) K2SO4的作用(提高沸点)沸点由330C提高到40OC加速了反应过程。(3) 硒粉和过氧化氢，氧化汞都为催化剂，但为了防止污染通常采 用硫酸铜(4) 50%NaOH 的作用下面我就针对几点来说明为何影响氨化完全和速度快的因素:( 1) K 氏烧瓶和取样量如果称1g以上的样品，就需要K氏烧瓶最小500ml, 8O01O0Oml 的更好，这样的K氏烧瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨 化效果最好。( 2)分解剂A H2SO4和K2SO4的添加量有机物分解需要H2SO4量，H2SO4应根据有机物种类不同而加的
8、量就不同，如果试样含脂类高，则加H2SO4 多,为了提高分解温度， 要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少则氨化不充分。 K2SO4和H2SO4的添加比例是：1g 样品 K2SO4： H2SO4=7g： 12ml这种比例在国内外都使用，是公认的还有一种比例： K2SO4：H2SO4=10：20mlB 催化剂用作催化剂的有Hg、HgO、Se,硒化合物，CuSO4、TiO2,对Hg, HgO有毒但结果好，Se与CuSO4得到结果是一种，TiO2,的结果偏 低,采用不同的催化剂则消化时间不同, HgO 消化麦子为 38, Se 与CuSO4消化麦子55, TiO2消化麦子70，所以在给出
9、测定结果时要 注明催化剂的类型。（3）热源的强度 消化时热源的强度同迅速消化和完全氨化关系很大,即便盐类K2SO4加得多，如果热源弱，也是没有意义的，热源过强导致H2SO4 损失,使氨回收率低，另外K氏瓶的容量大小，颈部的粗细和长短等， 也与热源的强度有关。（4）氨的蒸馏和吸收及滴定蒸馏有两种:1 直接蒸馏（装置简便,准确性好）2 水蒸汽蒸馏蒸馏加NaOH是50%，加的量为H2SO4量的4倍,硫酸量为12ml，则NaOH为12X4=48ml,而且一般高于这个理论值,即加到5055ml, 如果NaOH量加的不够就变成H2S, H2S是强酸，使颜色变红。 吸收液有：1 标准 H2SO4 用标准碱返
10、滴定，甲醛红指示剂2硼酸用HCl进行滴定，混合指示剂目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4,这样可省略了反滴定,H2SO4是强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，在滴定时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓度在 3%以上可将氨完全吸收，为保险期间一般用 4%。6实验注意事项a样品应时均匀的，若是固体样品应事先研细，液体样要混合均匀。b样品放入K氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，万一黏附可用少量水缓慢 冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。c消化时，如不容易呈透明溶液，可将K氏烧瓶放冷后，加入30%过 氧化氢催化剂23ml，促使氧化。d在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在 K氏烧
11、瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。e如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多底物被消耗掉或样品中脂肪含量过高 时，要添加硫酸量。f混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色，如果没有溴甲酚绿，可单独使用 0.1%甲醛红乙醇溶液。g氨是否完全蒸馏出来，PH试纸检查馏出液是否为碱性。h.向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀无。这时由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀，有时 Cu 离子与氨作用生成深兰色的络合物。i消化剂绿色后继续消化30分钟即可。2K氏微
12、量定氮仪法3 K氏半微量定氮仪法(2、3原理一样)操作方法大同小异，半微量法消化后，定容100ml，然后吸25ml蒸馏吸收液吸收。计算总氮 =(N(V2-V1) X 0014)/(W X10/100) X100对于微量定氮仪法，仪器有了改进，样液称样少，蒸馏消化液也少，其它基本一样。4K氏自动定氮法原理与上面一样，仪器，采用 K 氏自动定氮仪：其装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置，消化装置：由优质玻璃制成的K氏消化瓶以及红外线装置的消化炉。二 水扬酸比色法：1 原理： 样品中的 pro 经 H2SO4 消化转化为铵盐溶液后，在一定的 酸度和温度下与水扬酸钠和次氯
13、酸钠作用生成有颜色的化合物，可以 在波长660nm处比色测定，求出样品含氮量，计算蛋白质含量。2方法（1）标准曲线的绘制取6个25ml容量瓶编号0 1 2 3 4 5 6分别加空白酸液 2ml 分别加磷酸盐缓冲液 5ml稀释至总体体积至15ml分别加水扬酸钠 5ml37C水浴15分钟加入次氯酸钠 2.5ml37C 水浴 15 分钟取出试液于660nm下进行比色，绘标准曲线。（2）样品处理：准确称样02O1OOgf于K氏瓶中加15mlH2SO4和5g催化剂电 炉上加热到沸腾后f加大火力消化f直到出现暗绿色时f摇动瓶子 f K氏瓶全部消化后f冷却f加水至250ml容量瓶。3）样品测定：准确吸取上述
14、消化溶液10m|f于100ml容量瓶中f定容f准确吸2m于25ml容量瓶中f加5ml磷酸缓冲液f以下操作与标准曲线绘制的步骤相同并以试剂空白微对照，测得样液的光密度，从标准曲线查出其含氮量（4）计算含氮=CXF/ WX1000X1000 X 100C-从标准曲线中查出测定样液的含氮量（Ug）F-样品溶液的稀释倍数W-样品重量（ g）pro%=总氮%XK （K可为625，也可査）3 注意事项：A 当天消化液最好当天测定，结果重现性好，如果样液改至第二天 比色就有变化。B 当在 PH 和试剂适当范围内加入氯源后，颜色的显色和温度有关 应严格控制反应温度。C这种方法测定结果基本与K氏法一致。4 试剂
15、(1)氯标液：称经110C干燥2h的硫酸铵04719gf于烧瓶中定容 10ml此液1ml相当于1.0mg氮标液使用时配制成1ml相当于 2.50Ug氮标液。(2)空白酸液：称 0.50g 蔗糖加 15mlH2SO4 和 5g 催化剂与样 品一样消化定容250ml使用时吸收此液10ml加水至100ml为 工作液备用。(3)磷酸盐缓冲液：称71g磷酸氢二钠加38g磷酸三钠加20g 三九石酸钾钠加400ml水溶解过滤另称35gNaOH溶于100ml 水中冷至室温缓缓地搅拌加入磷酸盐溶液中加入水稀释至 1000ml 备用。( 4)水扬酸钠溶液：称 25g 水杨酸钠和 0.15g 亚硝基铁氰化钠溶于200ml水中过滤，加水稀释至500ml( 5)次氯酸钠溶液：吸 4ml 安替富民液，用水稀释至 100ml5 仪器( 1)分光光度计( 2)恒温水浴三 紫外分光光度法1 原理：pro 及其降解产物的芳香环基 ，在紫外区内对某一波长具有一定 的光选择吸收，在280nm下，光吸收与pro浓度(
