虫霉侵染桃蚜过程的激光共聚焦显微镜观察

《虫霉侵染桃蚜过程的激光共聚焦显微镜观察》由会员分享，可在线阅读，更多相关《虫霉侵染桃蚜过程的激光共聚焦显微镜观察（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、飞虱虫疠霉侵染桃蚜过程的激光扫描共聚焦显微观察摘要：飞虱虫疠霉菌侵染蚜虫发病过程的主要阶段及其特征。从传播接触、萌发侵入、潜育到症状表 现，在20-30r下,历期一般为3-5天。飞虱虫疠霉菌能自然流行，有效地控制多种蚜虫为害，是重要的昆虫病原 菌之一。由于研究的难度较大，至今国内外文献记载有限,soper和macleod,以及张效良等曾简略的记述了菌 的抱子形态。而对该菌的侵染发病过程未见根道。本次试验在研究利用该菌的过程中,对其侵染蚜虫的各个阶段， 利用Fluo - 3/ A标记钙离子并用激光扫描共聚焦显微镜观察飞虱虫疠霉初生分生抱子接种桃蚜后抱子萌发、 入侵以及菌体突破虫体的整个侵染过程。

2、同时用照片记录下整个侵染的过程。激光扫描共聚焦显微镜可动态观察荧光探针标记的细胞内Ca2 +i的时间和空间的荧光图像变化， 还可观察细胞某一层面或局部的Ca2 +i荧光图像和变化。荧光图像经光电倍增管和冷电耦合器件摄像机, 以数字方式输到计算机，计算出细胞或某一区域Ca2 +信号的时间和空间变化。总之，激光扫描共聚焦显微镜可 对培养细胞和固定的组织切片进行各种参数的检测3，且快速准确、自动化程度高,是研究细胞内Ca2 +及其 它参数的理想工具。本实验利用激光扫描共聚焦显微镜结合Fluo - 3/ AM能准确迅速地检测单个或多个贴壁粘附细胞胞内 Ca2 +i的动态变化，并同步观察虫霉侵染蚜虫各个

3、阶段细胞的形态变化。关键词：飞虱虫疠霉；桃蚜；侵染过程；接种；激光扫描共聚焦显微镜；Flu。- 3/ AM ；钙离子一.实验前准备1. 供试蚜虫以桃蚜Myzus persicae (Sulzer)的若蚜为生物测定对象，供试桃蚜在室内(20-24C, L12： D12)条件下 饲养于甘蓝植株或油菜植株上，从中选健壮无翅成蚜用离体甘蓝叶片法饲养。甘蓝叶的叶柄基部用吸足十字花 科蔬菜营养液的棉球包裹，使菜叶保鲜2周左右。每叶片放入直径90 mm的培养皿内，叶片上接入10头无翅成蚜 任其繁殖3天后去除成蚜，全部若蚜(40头/叶)用于接种。2. 供试菌种实验用飞虱虫疠霉菌株F98401,自杭州稻田自然病

4、死的白背飞虱(Sogattela f urcif er a)中分离纯化 而得，接种在SEA培养基80%的莎氏培养基，添加20%鸡蛋黄(PapierokandHajek,1997) 上,保存于4C 冰箱中。每隔2个月转接1次菌。实验前，将飞虱虫疠霉菌株在桃蚜虫体上连续复壮3次，以便恢复其较高的 致病力。3. 实验用到的培养基配方SEA培养基：葡萄糖4%,蛋白胨1%，酵母粉1%,琼脂1.5%，鸡蛋黄11.5%和牛奶8.5% SDY （萨氏培养基）培养液：葡萄糖4%,蛋白胨1%,酵母粉1%,琼脂1.5% 水琼脂培养平板：琼脂，蒸馏水4. 实验试剂前处理a荧光探针：Fluo -3/ AM （Molec

5、ular Probes Inc.）溶于纯净无水的二甲基亚砜（DMSO）中，配成1pg/ m贮 存液，放于-20C冰箱保存。b.非离子型的多元醇表面活性剂：Pluronic F - 127，以25 % （W/V）比例溶于纯净无水的DMSO中。C.无钙清洗液：含有（mmol/ L） NaCl 45、KCl 15、MgSO4、Hepes 10、葡萄糖 10 , pH 调至7.40。d. 含Ca2 +、Mg2 + 的PBS :在 1000ml 蒸馏水中，有NaCl 8g、KCl 012g、Na2HPO4 1.15g、KH2PO4 012g、015 %酚红液 4.0ml、MgCl2 H2O 0.1g、C

6、aCl2 0.1g ,用NaOH 调成pH = 7.40 .e. 前固定液成分：50mM PBS缓冲液（pH=7.8）； 2.5% 戊二醛；1% PA （焦锑酸钾）ddH2Of. 洗涤液成分：50mM PBS缓冲液（pH=7.8）； 1% PA （焦锑酸钾）ddH2Oh.后固定液成分：1% 锇酸；50mM PBS缓冲液（pH=7.8）； 1% PA （焦锑酸钾）5. 实验前激光扫描共聚焦显微镜的准备盖玻片的处理：为了方便在激光共聚焦显微镜上观察，免疫荧光样品通常需要制备在载玻片上。培养的细 胞需要在盖玻片上贴壁生长。盖玻片的厚度应小于0. 17mm。购买到的盖玻片需要用玻璃洗液浸泡处理一天以上

7、， 再用去离子水冲洗掉残存的洗液。盖玻片经过高温灭菌处理后，放置在细胞培养皿中，用于培养细胞。二实验进程1. 接种平板制备将在SEA培养基上生长的飞虱虫疠霉菌株接种到SDY培养液中摇动培养10天，获得的粘稠菌丝平铺于水 琼脂培养平板上，灭菌滤纸吸干水分,20C光照培养箱中培养，待产抱高峰出现时，用作接种平板。2. 蚜虫接种将接种平板倒扣在载有成蚜的叶片上。抱子浴接种2 h,期间转动培养平板，以保证接种均匀。然后将接受 抱子浴的蚜虫移入20C、相对湿度100%的环境中，并维持24 h的100%相对湿度，以保证附着于虫体表面的 抱子正常萌发。3. Ca2+细胞化学定位先用PBS缓冲液将储备液稀释为

8、10pM工作液。A. 样品前固定：在接种后的3、6、12、24、48、60和72 h,分别取4 - 5头蚜虫放入前固定液中固定3h.B. 洗涤：用PBS（ 0. 2 mol/L磷酸缓冲液）缓冲液洗涤三次，每次30分钟。C. 样品后固定：用后固定液固定,4C过夜D.洗涤液洗涤三次，每次30分钟；E .丙酮脱水：10-90%丙酮逐级脱水，一共9级，每级20分钟，100%丙酮脱三次，每次30分钟(整个过程在摇 床上进行)；1.环氧丙烷：丙酮=1：1 一次30分钟；2环氧丙烷三次，每次30分钟；3. 环氧丙烷：树脂=3： 1, 2小时(不加加速剂的树脂)；4. 环氧丙烷：树脂=1 ： 1, 4小时；5

9、. 环氧丙烷：树脂=1： 3,过夜；6完全树脂，48小时(干燥器内不加盖过夜，剩下树脂放于干燥器中)，中间换完全树脂一次；F.包埋，先于干燥器中放置12h,后将其摆正，并置于45C烘箱中3h,最后于60C烘箱中1-2天；4. 切片用震荡切片机切40-100mm厚片，5. 细胞检测将培养皿置于激光扫描共聚焦显微镜载物台上，选择适当的参数对细胞进行动态扫描，先测定静息状态即刺激 前细胞内Ca2 +i水平,100s时加入刺激物，观察细胞内Ca2 +i的动态变化情况。进入激光扫描共焦显 微镜Ki2netics - Image分析程序，对所扫描的荧光图像进行分析。桃蚜(Myz us per sicae)

10、是世界性分布的刺吸式口器害虫，危害多种农业和经济作物，在我国主要危害 十字花科蔬菜。由于孤雌胎生和世代历期短等特殊的生态对策，蚜虫化学防治抗药性农药残留问题特别突出. 因此，利用昆虫病原微生物控制蚜害一直是国际生物防治领域的研究热点。在我国长江中下游地区，桃蚜的主 要病原微生物是虫霉，如新蚜虫疠霉(Pandora neoaphidis )和安徽虫瘟霉(Zoop hthor a an huiensis )等， 常诱发田间蚜虫种群的流行病，在蚜虫的自然控制中起着十分重要作用。飞虱虫疠霉(Pandor delp hacis )是飞虱和叶蝉等刺吸式口器害虫的重要病原真菌.最近的研究证明该菌 对桃蚜表现

11、很强的毒力8,因具有快速杀蚜的特性而倍受研究者重视9 11.由虫霉感染致死的蚜尸，在 适宜环境尤其高湿条件下，体内的菌丝体自体表长出分生孢子梗，由此产生并向周围主动弹射分生孢子，在蚜 虫种群中传播并引发流行病2.虫霉感染蚜虫后一般要经历35d的潜伏期才将寄主杀死8.被感染的成 蚜在潜伏期内还能继续产生若蚜,成蚜死亡后所产生的孢子可弹射到子代若蚜上引起新的侵染，即继发性感 染。2. 1接种后蚜虫的变化接种后的前24 h,蚜虫无明显的异常行为，体色也无明显变化。36 h后蚜虫对外界的刺激反应迟钝，体色稍微 呈现微红或浅黄色。48 h后出现个别蚜虫死亡，体色微红。60 h后，死亡的蚜虫个体明显增多，

12、死亡症状十分 明显，身体肿胀膨大，体色微红或深黄色，但体表无分生抱子梗长出；此时从胸部腹面长出的假根已发育成熟, 将蚜虫固定于基物上，因此蚜虫身体腹部微微上举。72 h后，大量的分生抱子梗穿透虫体长出体外，并弹射抱 子，蚜虫尸体呈现深红色。2. 2抱子的萌发与入侵附着于虫体上的抱子萌发较为迅速，35 h后，已有60%以上的抱子萌发，12 h后几乎全部的抱子均已萌发， 并侵入到虫体内，虫体表面很难发现未萌发的抱子。努利虫疠霉的初生分生抱子在桃蚜体壁上的萌发方式有3 种：乳突两侧凹陷，乳突端伸长形成芽管（图版I： 1, 2）；乳突端凹陷，从乳突正对面的一端长出芽管（图版I： 35）；从乳突和其正对

13、面的一端各长出一个芽管（图版I： 7）,这种萌发方式较少出现，并且两端的芽管通常仅 有一端能成功入侵虫体。抱子入侵蚜虫寄主体壁所采取的方式有：萌发的芽管在寄主体壁上生长，寻找合适的 侵入部位，细长的芽管直接穿刺体壁，成功入侵（图版I： 5, 7）；抱子萌发形成附着胞，附着胞通常为球形（图 版I： 6）或棍棒状，侵入钉从附着胞上长出后穿刺寄主体壁。2. 3真菌突破寄主虫体接种60 h后，假根首先从蚜虫胸部的腹面长出体外（图版I： 8），将虫体牢牢固定在基物上。假根顶端成掌状分 枝，直径约为4060m（图版I： 9）。分生抱子梗首先从身体相对柔软的胸部背面节间膜处突破寄主体壁（图版I： 10），伸

14、出体壁的分生抱子梗迅速形成初生分生抱子，并弹射（图版I： 1114）。弹射分生抱子后，分生抱子梗 上有一明显的凹陷口（图版I： 12）,直径约为9肚m。72 h后分生抱子梗密布整个蚜虫体表，多数蚜虫体表呈现剧 烈的撕裂状（图版I： 15）。假囊状体在虫体表面并不多见，且通常出现于虫体两侧，较粗壮，宽度约有7. 8 16. 2 ttra（图版I： 13，14）。114 载玻片的处理制备的血小板在无钙的清洗液中处于悬浮状态，为使其粘附于载玻片，必须首先对载玻片进行预处理。用对 血小板无毒性、不激活的Polyethyleneimine （日本Tsuroga WomenAs J uniorColleg

15、e Hi Roaki Nishio 博士 惠赠）溶于蒸馏水中配成1 %的稀溶液，把载玻片放入稀溶液中浸泡5min,取出后放入25 C烤箱缓慢烤干，待 用。盖玻片用酒精处理，消除它对荧光的吸收作用，或使用无荧光的盖玻片。115 荧光试剂的负荷荧光染料Fluo - 3/ AM的负载参考文献方法5进行不同浓度、不同孵育时间的预实验后确定。制备的 血小板中加入Fluo - 3/ AM , F - 127 ,分别使其终浓度为20“ M和2 % （W/ V），在37 C，5 %的C02孵箱 内孵育60min，取出后用含Ca2 +，Mg2 +的PBS清洗2次，即可用于观察。116 激光共聚焦显微镜监测将染好

16、色的血小板置于处量好的载玻片上，用处理过的盖玻片轻轻盖上，避免产生气泡。选择附壁良好的 细胞进行观察，确保在加药过程中细胞位置不变。在40倍长工作距离的物镜下动态观察Fluo-3TAM指示Ca2 + 的变化。在TimeSeries程序下，开始预扫描，调节扫描参数，以取得最大信号、最小光漂白与最好的信噪比。 数据采集间隔时间为012秒，X点为43，Y点为38，扫描次数为200次。参数确定后，动态扫描5次，测定 静息状态下血小板胞浆内游离钙水平后，立即用微量加样器将少量药物从盖玻片边缘渗入，依赖药物扩散，持 续作用于细胞，所加药物浓度为最终稀释浓度。激光扫描共聚焦显微镜的使用3. 1样品制备3. 1. 1切片实验标本要求单层，并能很好地贴附在样品池中。