细胞损伤模型

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1、细胞损伤模型一、体外肝细胞损伤模型建立（CCI4和H2O2 ）1 大鼠肝细胞的分离和培养大鼠4%戊巴比妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继 以37 C通入02的IV型胶原酶灌流液继续循环 灌流15 min 。将肝脏移至一平皿内，轻轻撕去 肝包膜后，加入含5 %小牛血清的清洗液，用吸 管吹打成单个肝细胞悬液，200目尼龙网过滤， 低速离心（500 r min-1 ， 1 min ，4 C ）弃 上清，同法用清洗液反复洗 3次。然后用完全 1640 培养液（内含 10 %小牛血清，105 U -L-1 青霉素，100 mg - L-1 链霉素和10 mg - L-1胰岛素）制成1 x 109

2、个L-1肝细胞 悬液。分离的肝细胞经0.6 %台盼蓝拒染法测得 细胞活力大于90 %，高碘酸雪夫反应显示糖原 法鉴定99 %为肝实质细胞。将上述肝细胞悬液分别加入 24孔（每孔1 ml ） 和96孔（每孔0.1 ml ）培养板中，置37 C， 5 %CO2培养箱中培养。1216 h后可见肝 细胞贴壁于培养板孔底上生长。2 CCI4诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立 肝细胞培养12 h后，吸弃上清，更换培养液并 加入不同浓度的CCI4 （ 116 mmol L-1 ）,以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚 砜终浓度为0.1 % （体积分数）作用不同时间（112 h ）后，收集24孔板中培养上清检测AST，以

3、及肝细胞的MDA含量和GSHpx活 性；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反 应。根据检测结果制备CCl4诱导肝细胞损伤的 量效和时效曲线。选择最造损伤浓度和损伤时间 制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每 组至少设3个复孔。3 H2O2 诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立 同法更换培养液，加入不同浓度的H2O2（0.23.2 mmolL-1 ），作用不同时间（0.54 h ）后，收集24孔板中培养上清检 测ALT，测定肝细胞的MDA含量；同步测定 96孔板中培养肝细胞的 MTT反应。根据检测 结果制备H2O2诱导肝细胞损伤的量效和时效 曲线，选择最适损伤浓度和损伤时间制备肝细胞 的损伤模型

4、，同时设溶媒对照组，每组至少设3个复孔。4 检测指标(1 ) AST、ALT的测定 培养的肝细胞经离 心(1 800 r -rmin-1, 10 min )后收集上清，按试剂盒说明书步骤测定上清液中AST和(或)ALT活性，结果以U(106 cell)-1 表示。(2 )肝细胞增殖试验采用MTT比色法。(3 ) 肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶(GSHpx ) 活性的测定先制备GSH标准曲线。弃肝细胞 培养上清，加入 0.2 % Triton-100 水溶液0.5 ml，混匀，2 min 后，离心(2 500 r min-1，10 min )，取上清液(肝细胞样品)0.4 ml，另设样品空白管，非酶反

5、应管和试剂 空白管，加入各种试剂。混匀后立即计时，静置12 min 后，以样品空白管调零点，于423 nm 波长处读得吸光度(A )值。在GSH标准曲线 上查出对应的GSH波度。GSHpx酶活力单位 是在37 C，pH6.5 条件下，每106个肝细胞、每分钟使GSH浓度下降1卩mol为1个酶活 力单位。计算公式为：GSHpx 活力单位=(GSH 非酶管-GSH 样品管-GSH 试剂空白管)/3。结果以U(106 cell)-1 表 示。(4)肝细胞丙二醛(MDA )含量的测定 先 制备MDA标准曲线。弃肝细胞培养上清，加入 生理盐水1 ml，混匀，移入离心管中，离心(2 500 r min-1

6、 ，10 min )，弃上清，加 15 % TCA 2 ml，破坏细胞并沉淀蛋白质，加入0.67 % TBA 2 ml，于沸水浴中加热30min。根据样本的吸光度值在标准曲线上查出对 应的浓度，结果以nmol (106 cell)-1 表示。(5 ) 数据处理 数据以s表示，计量资料 组间比较采用t检验。两变量间相互关系，采用 直线相关和回归分析。二、体内肝损伤模型(酒精)1、材料 纯系SD雄性大鼠，体重180g200g，由浙江大学医学院实验动物中心提供。食用 酒精选用北京酿酒总厂出品的56度红星二锅头。2、方法 将大鼠随机分成5组，饲养在23 C 25 C室内，自由进食、进水；根据大鼠体重，

7、A、B、C、D组每日用56 红星二锅头白酒以 10ml/1Kg 分别灌胃0、4周、8周和12周;E组于酒精灌胃12周后，停止灌胃4周。大鼠 通过股动脉米血处死，收集血浆和肝脏标本。3、主要指标检测(1 )肝功能：应用日立7170自动生化分析仪 测定总蛋白(TP )、白蛋白(Alb )、球蛋白(Glb )、 丙氨酸氨基转移酶(ALT )和天冬氨酸氨基转移 酶(AST、等。(2、氧化抗氧化物质测定：采用南京建成生物 工程研究所提供的试剂盒分别检测丙二醛(MDA )、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、谷 胱甘肽(GSH )、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-S-转移酶（GST ）（3 ）大鼠肝脏病

8、理检查：大鼠处死后立即取出 肝脏，称重后一部分以10%的福尔马林液固定 作病理，作常规石蜡切块并HE染色，在光学显 微镜下进行观察，用半定量法分别判定脂肪变 性、及酒精性肝炎炎症活动度三、四氯化碳体外损伤肝细胞模型原代培养的正常大鼠肝细胞培养 24h （贴壁良 好）后，置培养皿于一密闭的塑料盒，内置四氯 化碳0.4M 容积，37度90min ，造成肝细胞 损伤的模型，后转入正常培养，进行下一步实验。 （即熏蒸法）肝细胞培养12h后，吸弃上清，更换培养液并 加入CCL4 8mM （事先用 DMSO 溶解， DMSO终浓度1 %），作用6h后收集24孔板 中培养上清检测AST以及肝细胞MDA含量盒

9、 GSHpx活性，评价损伤程度。（常用方法）四、醋氨酚体外损伤肝细胞模型 肝细胞培养24h后，用清洗液洗2次，培养液 洗1次，然后换以20mM 醋氨酚的培养液，继 续培养12h，取培养液，进行下一步实验。五、过氧化氢体外损伤肝细胞模型肝细胞培养24h后，吸弃上清液，更换培养液 并加入H2O2 0.6mM ，作用1h后，收集24 孔板中的培养上清液检测 AST活性和MDA含六、氰化钾缺氧肝细胞损伤模型肝细胞培养24h后，贴壁生长良好的肝细胞中 加入氧化钾2.5mM ，继续培养2h，定量检测 培养液上清中LDH活性，以及酶的活性反应肝 细胞损伤程度。本模型可以更好的模拟缺氧损 伤。七、硫代乙酰胺（

10、TTA ）体外肝细胞损伤模型肝细胞预培养24h后，贴壁生长良好的肝细胞 中加入 TTA0.18mM，继续培养 48h，肝细胞大量损伤和坏死，上清液中乳酸脱氢酶(LDH )活性升高，造成体外损伤肝细胞模型。八、内毒素体外损伤肝细胞模型贴壁生长良好的肝细胞中加入内毒素 70uL/mL ，置37度，5 % CO2培养此时上 清LDH活性升高造成肝细胞损伤模型，造成体 外肝细胞损伤模型。九、半乳糖胺(GalN )体外损伤模型分离肝细胞，预培养12-24h 后，待细胞贴壁 生长均匀后，加入5mMGalN 的肝细胞培养液， 继续培养1.5h，测定培养上清液中 ALT，ALT 显著升高时，肝细胞造模成功。十

11、、帕金森体外模型体外培养的中脑多巴胺能神经元 MPTP损伤模I实验操作：实验采用胚胎龄14 一 16天的大 鼠，剖子宫取胎，取胎鼠中脑腹侧区。可将多个 胚胎来源的组织收集在一起，置FI2培养基(Gibco )至35mm 的培养皿中，以细剪刀剪 碎。将2ml含0.125 %的胰酶的F12加入到 组织中，该混合物于37 C孵育10分钟后，加 入 DNase I (Sigma )至终浓度 80ng / m1 ， 继续于37oC 孵育10分钟。消化后的组织以 尖端被火抛光的移液管轻轻吹打 8次。该细胞 悬液以种植培养基稀释(种植培养基：MEM，补充以2mm 谷氨酰胺，6mg/ml 葡萄糖， 1mg /

12、ml谷胱甘肽，10 units /ml青霉素， 10ul/ml链霉素和7.5 %胎牛血清)。细胞然后种植于35mm 的预先以10ug / m1 po1y1ysine ( Sigma ) 和 2.5ug/ mlmeros in (Chemico n )铺底的培养皿中，种 植密度为50,000 细胞/ cm2。培养16小时 后，培养基换为无血清培养基。该培养基为F12 和 basa1Eag1e s medium，补充以 33mM葡萄糖，2mM 谷氨酰胺，15 mM 碳酸氢钠， 10mM HEPES (pH7.0 ), lug /ml 谷胱甘 肽，20ug/ml 胰岛素，100ug/ml 转铁蛋 白

13、，60uM 腐胺，20nM 孕酮，20nM 亚硒 酸钠(NaSe ),30nM 三碘甲状腺原氨酸，0.5 unit/ml 青霉素和0.5mg/ml 链霉素。毒物处理：于第4天以1uMMP+ 处理48小 时。然后进行分析。模型评价：倒置显微镜下观察细胞形态、细胞计 数、免疫组化检测TH阳性细胞的数目和形态。体外培养的中脑多巴胺能神经元 6-OHDA 损 伤模型采用上述方法选择胎鼠，分离中脑腹侧部，解剖 显微镜下仔细剔除脑膜和血管，用高糖 T-BSS 反复冲洗涤之七遍。并将组织剪碎，移入0.25 % 胰蛋白酶溶液中，37oC振荡消化30分钟，后 加入血清数滴终止消化，用吸管轻轻吹打后，加 入不含血

14、清的DMEM 培养液混匀，lOOOrpm , 10min 离心收集细胞，反复2次, 后加入含血清的完全DMEM培养液悬浮细胞， 过220目不锈钢筛网使成单细胞悬液，计数后 将约3X 106个细胞接种人事先涂有多聚赖氨 酸的35mm 的六孔培养板中，置37oC、5 % CO2培养箱中培养。24小时后待细胞完全贴 壁时，置换旧培养液，以后每隔 2天更换一次 培养液。培养至第六天时加入100uM 的 6-OHDA 处理3小时后吸出。在相应备孔中加 入完全DMEM 培养液洗涤2遍，再加入完全 DMEM 培养液继续置 5 % CO2培养箱中培养 24小时，采用与上述相同的方法做免疫细胞化 学染色，计数T

15、H阳性细胞，确立6-OHDA 对 体外培养的多已胺能神经元的损伤作用。十一、A B损伤模型取出生1-2d 的乳鼠，用麻醉剂处死。在 D-ha nks 液中取大脑并分离海马组织，胰蛋白 酶消化，获得细胞悬液，胎盘蓝染色进行死活细 胞记数，将细胞以5X 105/ml的密度接种于预先经L-多聚赖氨酸处理的96孔和24孔培养板，其中24孔板中预先放置有盖玻片。细胞 维持在培养液中，置入 5%CO2 ，饱和湿度的 培养箱中培养，24h后全换液，接种当天为第 一天，每3d半量更换培养液一次，培养第 3天 时加入阿糖胞苷,终浓度为10卩mol/ L ,以抑 制神经胶质细胞的过度增殖,24 h后更换全部培养液继续培养，第10天进行细胞造模，开始 实验。也可以用PC12细胞株,常规培养A B产物诱导海马神经细胞，建立细胞模型：选择A B 25-35 片段，用三蒸水配制成 100 a mol? L -1,过滤，分装,-20 C冻存；使 用前老化处理并配制成所需浓度。（将A 3 25-35溶解在DMSO 中，在用DMEM 稀释， 置于37 C下孵育7-14天，即为老化状态）。细胞模型建立：加入浓度为20?mol/L 的A 3 25-35,接触24h,诱导建立AD细胞模型检测指标：MTT LDH凋亡细胞内钙离子以 及SOD等十二、抑郁症的体外模型