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1、高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因一、目的要求1、学习高效液相色谱仪的操作。2、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理。3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。二、基本原理咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱， 它属黄嘌呤衍生物，化学名称为 1,3,7-三甲基黄嘌呤。咖啡因能兴奋大 脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中含咖啡因约为 1.21.8%，茶叶中约含 2.04.7%。可乐饮料、APC药片等中均含咖啡因。其分子式为C8Hi0o2N4, 结构式为：CH3定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相 高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸
2、 蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系 统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们 在色谱图上的保留时间tR和峰面积A后，可直接用tR定性，用峰面积RRA 作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的 咖啡因含量。三、仪器和试剂1、日本岛津公司LC-20A高效液相色谱仪。2、色谱柱：Kromasil C18, 5卩 150X4.6mm。3、流动相： 30%甲醇（色谱纯）+70%高纯水；流动相进入色谱系 统前，用超声波发生器脱气 10min。4、咖啡因标准贮备溶液：将咖啡因在110C下烘干1h。准确称取 0.1000g 咖啡因，用二次蒸馏水
3、溶解，定量转移至 100mL 容量瓶 中，并稀释至刻度。标样浓度lOOOgmL -1。5、测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。6、20m L平头微量注射器。四、实验步骤1、标准贮备液配制质量浓度分别为20、40、60、80ygmL-i的标准系列溶液。（1mL, 2mL, 3mL、4mL稀释为50mL）2、谱仪器条件：3、泵的流速：1.0mL/min；检测波长：275nm；进样量：10pL；柱温：室温。4、仪器基线稳定后，进咖啡因标准样，浓度由低到高。5、样品处理如下：（1）将约25mL可口可乐置于一 100mL洁净、 干燥的烧杯中，剧烈搅拌30min或用超声波脱气5min,以赶尽可 乐中二氧化碳
4、。（2）准确称取0.04g速溶咖啡，用90C蒸馏水溶 解，冷却后待用。（3）准确称取0.04g茶叶，用20mL蒸馏水煮沸 10min,冷却后，将上层清液，并按此步骤再重复一次。将上述三 种样品分别转移至50mL容量瓶中，并定容至刻度。6、上述三份样品溶液分别进行干过滤（即用干漏斗、干滤纸过 滤），弃去前过滤液，取后面的过滤液，备用。7、别取5mL可乐、咖啡饮料和茶叶水用0.45pm的过滤膜过滤后， 注入 2mL 样品瓶中备用。8、“日本岛津公司 LC-20A 高效液相色谱仪操作规程”分析饮料 试液。五、结果处理1、测定每一个标准样的保留时间（进样标记至色谱峰顶尖的时 间）。2、确定未知样中咖啡因的出峰时间。3、求取样品中咖啡因的浓度。记录实验结果，将标样的数据利用EXCEL软件绘图，并计算回归方程。最终将茶叶、百事可乐、速溶咖啡测试所得的峰面积代入回归 方程计算浓度：六、注意事项1、不同的可乐、茶叶、咖啡中咖啡因含量不大相同，称取的样品量 可酌量增减。2、若样品和标准溶液需保存，应置于冰箱中。3、为获得良好结果，标准和样品的进样量要严格保持一致。七、思考题1、用标准曲线法定量的优缺点是什么？2、在样品干过滤时，为什么要弃去前过滤液？这样做会不会影响实验结果？为什么？
