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1、来源：华中农业大学第一章 有害生物检验的概念及意义1、什么是QP、RNQP、RP、NRP?检疫性有害生物(Quarantine pest, QP)：指对某一国家或地区具有潜在经济重要性，但在该国 或该地区尚未存或已存在但分布未广并由官方控制的有害生物。(IPPC,1997)限定的非检疫性有害生物(Regulated non-quarantine pest，RNQP): 一种存在于种植材料上， 危及这些植物的原定用途而产生无法接受的经济影响，因而在输入国和地区受到限制的非检 疫性有害生物(IPPC,1997)非限定的有害生物(Non-Regulated pest, NRP)：广泛发生或普遍分布的
2、有害生物，在植物检疫 中没有特殊的意义。如：青霉菌、曲霉菌等。限定性有害生物(Regulated pest, RP): RP are those pests for which measures and actions would be undertaken if they were intercepted or detected 。 /A quarantine pest or a regulated non-quarantine pest (IPPC,1997)2、开展植物有害生物检疫有什么意义？加强植物检疫具有重要的社会意义。 加强植物检疫具有重要的经济意义。加强植物检疫 具有重要的生态意
3、义。3、检验在植物有害生物检疫中起什么作用？ 检验结果是决定检疫处理和出证的重要依据。检验结果决定货物是否流通。检验结果的准确 与否关系到输入国或地区的生态和农牧业安全。有时涉及到国际贸易的争端。第二章 有害生物检验的生物学基础及现场检验1进行有害生物的扩散、蔓延趋势预测的依据？20世纪 80年代以前，依靠传统的技术手段肉眼观察、显微镜技术(20世纪 50-60年代及以前)多克隆血清学技术检验(始于 20世纪 70年代) 包括玻片凝集实验、琼脂双扩散技术、酶联免疫吸附等。20世纪 80年代以后引入的分子生物学技术单克隆抗体血清学技术检验免疫电镜和荧光显微镜技术分子杂交技术PCR 及其衍生技术（
4、20世纪 90年代）（1985年报道）包括Nested-PCR,实时荧光PCR,多重PCR等基因芯片技术（21 世纪新技术）（2002 年报道2有害生物传入新区后的危害性有哪些表现形式？ 有害生物在自然界分布的区域性，含义：每种生物都有一定的地理分布范围。同样，在每一 个地理区域都有一定的生物种群分布。各个生物间在长期的自然选择中处于一种相互依存、 互相容忍、互相制约的相对稳定的自然生态平衡。就构成了有害生物的区域分布。有害生物的人为传播。随着目前国际交流的日益频繁，人为传播有害生物的作用也日益扩大， 因而人为传播有害生物的作用也更为突出。因此，在当今社会，通过植物检疫来防止有害生 物的传播也
5、比以前更为重要。有害生物传入新区后的危害性。新区气候条件不适宜，或无寄主植物，或无传病媒介，不可 能成为传入有害生物的分布区。新区与原产地在气候、寄主等生态条件相近似，或传入有害生物的适生性强，新区成为新分 布区乃至严重危害区。传入有害生物由于适生条件的变化危害加重乃至成为毁灭性的病害。3 新区传入有害生物危害加重的原因？ 新区的气候条件和其它环境条件（如传播媒介等）较原产地更利于新传入有害生物的生长 繁殖和危害。新区寄主抗性弱，为新引进的有害生物提供更有利的繁殖、流行寄主条件。 新传入有害生物由于适应新区的生态条件而发生变异，形成了致病力更强的病原菌生理小 种、菌系或毒素。4 什么是现场检验
6、？现场检验（On-the-spot Inspection）:是检疫人员对进出境的应检物进行现场检查，以确认是否符合 相关检疫要求的法定程序。5现场检验常采用哪些方法？包括肉眼观察、过筛检验、X射线机检验和检疫犬检验，过筛检查，肉眼检查，抽样检验。第三章第一节植物病原真菌的检疫检验1，病原真菌的传播途径有哪些？具有检疫意义的途径是什么？ 真菌病害种类多，绝大多数可以通过寄主植物或产品的调运进行远距离传播，引起异地危害。 列入检疫性有害生物的病原真菌有 90 多种，在中华人民共和国进境植物检疫危险性病、 虫、杂草名录中，1类真菌11种，2类2种，3类73种（A类丿；全国农业植物检疫对 象名单有5种
7、（B类丿。2，种子带菌保湿培养依据的原理是什么？ 种子携带的病原真菌（粘附在种子表面或潜伏在种子）在适当的温湿度条件下或种子萌动后， 即开始生长或侵染，在种子表面产生菌丝体或繁殖体。3 , DFB的检验步骤有哪些？ DFB的优缺点是什么？深冻吸水纸法检验（Deep Freezing Blotter Method, DFB）DFB是SBM的改进。可促进某些真菌的生长，而对腐生菌的生长有一定的抑制作用。步骤培养时，将培养皿置20C放置24h,然后转移至-20C深冻24h，再在202C的条件下 培养5d,其它条件同SBM。SBM优缺点这种检验方法，简单易行，并不需要特殊的设备， 操作也方便，所以应用
8、很广。但对于种子带菌而萌发期或苗期不表现病征的病菌这种方法不 适宜。且腐生菌常干扰实验结果。改进的SBM或DFB是对SBM和DFB的改进。可进一步对腐生菌的生长进行抑制。 4，琼脂平板法检验的优缺点有哪些？优点：琼脂平板检验尤其适合于当在吸水纸检验中不能提供病原菌菌丝生长、孢子发芽或症 状产生所需条件，而在富营养的琼脂中能产生特异性菌落的种子真菌检验。缺点：适用于受腐生菌影响较小的种子，多种真菌的混合感染，可能相互掩盖或抑制，在这 种情况下可能有必要使用选择性培养基。5，在种子带菌洗涤法检验中，如何进行菌的数量计算？ 种子带菌的萌芽法检验的优缺点 优点：采用这种方法，能较容易观察幼苗的症状；还
9、可了解种子的发芽率和发芽势。 缺点:耗时，约 2 周左右；某些腐生菌可能变成萌芽阶段的寄生菌，造成幼芽产生病斑；多 种病害可能产生同一种病害，同一种病害也可能产生不同的症状。要克服这些缺点须结合其 它辅助手段。1 ，平均视野法5 个玻片共观察 50 个视野。 计算每克种子的孢子数：毎克种子的孢子数=（平均毎视野孢子数X盖玻片视野数X毎毫升悬浮液滴数X悬浮液定 容体积丿/种子质量（g）。其中，盖玻片视野数=盖玻片面积/视野面积2，血球计数板计数 显微镜下观察每小格的孢子数目，共观察80小格的孢子数目，求平均数。孢子数（个丿/g种子=毎小格平均孢子数X 4000000 X洗涤液总体积/种子重量血球
10、计数板毎小方格的边长为0.05mm，深度为0.1mm6，真菌接种检验常采用的接种方法有哪些？分离培养生长检验等种子带菌的保湿培养检验吸水纸检验法深冻吸水纸法琼脂平板法 种子带菌的萌芽法检验 种子带菌的洗涤法检验第二节 植物病原细菌的检疫检验1，细菌鉴定的主要依据有哪些？革兰氏染色反应;门 形态特征：细胞形态、鞭毛数量和着生方式;属 生理生化特性:在特定培养基上的生长特性、色素的产生、生理生化反应等。种2，鞭毛染色的依据原理及常用方法是什么？需注意哪些方面？原理鞭毛很细，0.02-0.03卩m,光学显微镜一般看不到，通过染色，使染色剂沉积在鞭毛上使之加 粗，则较容易在显微镜下观察，因此可用这种方
11、法初步鉴定细菌种类。常用的染色方法包括格里斯氏(Griess)试剂法、西萨-基尔(Ceseres-Gill)染色法和银染法。 鞭毛染色注意事项注意菌龄：一般适宜温度培养了 16-24h的新鲜细菌为宜。注意温度：接近生长温度比较适宜，避免忽冷忽热。低于20C时应采用恒温装置保持恒温， 以免鞭毛脱落。注意载玻片干净无油腻。3，细菌分离培养的常用方法有哪些？培养皿稀释分离将待分离的植物组织切成小块(4mm2)，经表面消毒后，在无菌条件下置盛有少量无菌水 (0.5ml)的培养皿中研碎，静止20-30min，然后用移植环取2-4环到另一盛有少量无菌水的培 养皿中，混合均匀后，以同样的方法从第二个培养皿移
12、到第三个培养皿中。然后在各培养皿 中倒入冷却至45 r左右的培养基，凝固后翻转培养皿，在适宜的温度下培养观察。平板划线分离采取与培养皿稀释分离方法制备组织浸液，然后用灭菌移植环蘸取浸液在琼脂平板上划线， 一般先在平板的一侧划3-5 条，再将培养皿转 90后，从第二条线的末端划出3 -5条线4，细菌生化测定依据原理是什么？原理 测定其生长受温度条件的影响、盐分耐受性；对碳源、氮源、大分子化合物的利用和分 解产酸、产气、颜色变化等；产生的酶及对抗生素反应将细菌鉴定到种。5，细菌接种检验常用的接种方法有哪些？目的：将分离到的病原细菌接种到特定的寄主植物上，在一定的控制条件下观察植物的反应。 方法：在
13、固体培养基上培养的新鲜细菌加灭菌水配置成一定的浓度的悬浮液(107-108cfu/ml),然后接种；接种的方法：根据病害传播方式和侵入途径选择适宜方法。包括针刺接种、喷雾接种、剪叶 接种、注射接种、伤口接种等。6，噬菌体法检验的优缺点有哪些？ 感染细菌的病毒，能在活细菌细胞中寄生繁殖，破坏和裂解寄主细胞。在液体培养时，使混 浊的细菌悬浮液变得澄清，在固体平板上培养时，则出现许多边缘整齐、透明光亮的圆形无 菌空斑，称为“噬菌斑”，肉眼即可分辨。噬菌体法的主要优点 简便、快速，能直接用种子提取液测定。缺点 非目标菌大量存在时敏感性较差；噬菌体的寄生专化性和细菌对噬菌体的抵抗性都可 能影响检验的准确
14、性。应用现状 在实践中能用噬菌体检验的植物病原细菌不多，因噬菌体和细菌都有生理分化现象。7，在制备细菌抗血清时，为什么要除去鞭毛？ 植物病原细菌的鞭毛和整个菌体都可作为抗原；纯化的抗原，包括多种方法浸提的核糖体 糖蛋白和膜蛋白等。8，免疫荧光技术的反应原理是什么？该方法有哪些优缺点？原理：将抗体 IgG 与荧光素进行结合形成一种带有荧光标记的抗体，当有相关的抗原与抗体 发生反应时，可以形成抗原抗体荧光素复合物，借助荧光显微镜的光激发，可看到荧光 素发出的特殊荧光免疫荧光技术的优缺点： 优点：可以直接观察到菌体形态以及其表面抗原是否与抗体反应，发生特异反应得细菌菌体 外可见明显的荧光。缺点：各种
15、荧光染料激发和发射的荧光能力有限，经过一定时间后荧光会逐渐消失。需 1h 内完成观察，或于4C保存4h。第三节 植物病原线虫的检疫检验1，线虫漏斗分离法依据原理是什么？原理依据线虫的活动性及密度大于水的特性，在适当温度下(最好20-25 C左右丿将破碎 待检材料放入水中，线虫游入水中，并沉入管底，取5ml显微观察。2，漂浮分离法依据原理是什么？适用哪些对象？分离土壤中马铃薯金线虫Globodera rostochiensis）和各种胞囊线虫（Heterodera丿的胞囊。 原理 干燥的胞囊比重较轻，可从水中漂浮出来。方法 漂浮器分离法等漂浮器装水f 土样放在16目上筛f 水流冲洗土样f胞囊等物流入漂浮筒，并浮在水面f经 环茎水槽流入60目底筛f经水浮起胞囊转移至滤纸f晾干显微观察。一次可处理 25-50g 样品， 10min。3，线虫永久玻片制作过程的主要步骤有哪些？永久玻片打一蜡环f内加1小滴纯甘油或加入0.0025%棉兰或酸性品红f 加入脱水的线虫及玻璃 丝f加热盖玻片f用硬甘油明胶或其它商业化封固剂封固。附：硬甘油明胶：明胶7-9g,苯酚1g,纯甘油49ml,蒸馏水42ml.4，固定线虫常用的染色方法及其优点是什么？固定线虫的染色染色步骤：加3-4滴多色蓝f55-60C水浴加热f3
