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1、关于细胞自噬的相关研究成果姓名：陶宗 学院：化学化工学院专业：化学 学号：160106010012016年度诺贝尔生理学与医学奖刚揭晓不久，获奖者为日本科学家大隅良典(YoshinoriOhsumi),以奖励他在“细胞自噬机制方面的发现”。细胞自噬这是细胞组分降解与再利用的基本过程。“自噬 (autophagy厂词源丁希 腊 语前缀“ auto ”，意为“自我”，以及另一个希腊语单词“ phagein”，意为“吞食”。因此， 自噬作用的意思非常明确，那就是“自我吞噬”。“自噬”的概念由比利时科学家Christian de Duve在1963年溶酶体国际会议上首 先提出，是指一些需降解的蛋白质和
2、细胞器等胞浆成分被包裹，并最终运送至溶酶体降解的过程，自噬性降解产生的氨基酸和其他一些小分子物质可被再利用或产生能量。现 已明确，自 噬的主要功能之一实际上是在细胞受到应激性的死亡威胁时保持细胞的存活，这是真核细胞维持稳态、实现更新的一种重要的进化保守机制。虽然广义上的自噬 包括巨自噬 (macroautophagy) 微自噬(microautophagy 河分 子伴侣 介导的 自 噬 (chapeon-mediated autophagy种类型，通常所说的自噬即指巨自噬，也是目前研究最多的。对这一过程开展研究非常困难，这也就意味着我们对其知之甚少。直到上世纪1990年代，在经过一系列出色的实
3、验之后，日本科学家大隅良典利用 面包 酵母找到了与自噬作用有关的关键基因。随后他开始致力丁阐明酵母菌体内自噬作用的背后机制，并发现与之相似的复杂过程也同样存在丁我们人类的细胞内。大隅良典 的研 究更新了我们关丁细胞物质循环的旧有观点，他的研究开启了理解自噬作用在许多生理过程中关键作用的崭新道路，如生物体对丁饥饿的适应或者机体对丁感染的反应。自噬基因的突变会导致疾病的发生，自噬作用机制在一些类型的疾病，如癌症和神经疾病等病症中也发挥了作用。我们人体的细胞内部拥有很多不同功能的细胞器,而溶酶体只是其中的一种，其内部含有能够消化自身细胞器的特殊酶。在细胞体内还能观 察到大量存在的，被 称作“吞噬小体
4、”的特殊囊 体。随着吞噬小体的形成， 它会不断包裹细胞内部物质，如那些受损的蛋白质和其 他细胞器。最 后，这些小体会与溶酶体相结合，这一机 制为细胞提供了营养与物质更新的途径。20世纪70年代至80年代，研究人员主要专注丁研究另一套用来降解蛋白质的系统，即蛋白酶体(proteasome 在该研究领域，阿龙 -切哈诺沃（ Aaron Ciechanover* 阿夫 拉姆 -赫什科（ Avram Hershko ）和美国科学家欧文- 罗斯（ Irwin Rose ）被授予 2004 年诺贝尔 化学奖，以表彰他们在泛素调节的蛋白质降解研究领域中的卓越成就。蛋白酶体虽然能 有效地逐步降解蛋白质，但该机
5、制仍未能解释细胞是如何消除大型蛋白质复合物和受损 的细胞器。:、细胞自噬的研究方法目前，人们对自噬的检测主要包括基于检测自噬体的直接（观察自噬体的形态）和 间接（检测自噬体表面蛋白标记）的方法以及基于自噬性降解原理设计的一些方法。除此之外，还可通过对自噬通路的调控来全面评价自噬功能对细胞行为或机体功能的影 响，如自噬抑制或激活剂、自噬相关基因的敲除及沉默等。近年来，一些自噬基因缺陷 的动物模型及体内自噬活性分析方法的建立使得自噬研究设计更为合理、 结果更具有说服力。需要特别指出的是，在有些文献上能看到通过一些荧光染料（如 lysotracker 、monodansylcadaverine ac
6、ridine orang? 标记的方法检测溶酶体的数量和活力来反映自 噬，目前认为这种方法缺乏特异性，不能够代表自噬的出现。此外，还有检测一些自噬 相关蛋白 （如Beclin-1 、 Atg5 ） 的 mRNA 及蛋白质水平表达的方法，实际上，这也不能 够反映自噬的激活，因为在自噬过程中，这些蛋白的激活表现在其翻译后的修饰以及蛋 白问的相互作用，而并不是表达量的增加 . 在对待以上两种方法得出的结论时需理性看待，避免盲从。（一） 自 噬性结构的电镜下形态学观察 自噬检测的金标准透射电子显微镜是观察自噬现象的最直接、最经典的方法。电镜检测自噬主要是基于辨认自噬体结构，半个世纪前科学家就借助电镜最
7、先观察到了自噬体结构。自噬体通 常是双层膜结构包含着未消化的胞浆成分或细胞器 （如线粒体、内质网片段） ，并未与 溶酶体融合。电镜下自噬体内容物的形态和电子密度与胞浆中的一致，因此容易识别。 自噬体融合成自噬溶酶体后，则变成单层膜结构，其中含有降解不同阶段的胞浆成分。 一般来说，降解的物质电子密度会增加，形成黑色颗粒状或不定形的聚集，因此也能够 辨认 1-2 。只是对于晚期自噬溶酶体无法识别内容物质的来源。在实际操作的时候，如 没有特殊的标记是难以区分自噬体、自噬内涵体和自噬溶酶体等不同成熟阶段结构的， 因此，只能根据其内容物的结构完整情况大致用初始自噬囊泡（ AVi ）和降解自噬囊泡（ AV
8、d ）来表示，其中 AVi 内含的胞浆物质结构完整， AVd 内容物则被不同程度降解 3-4 。（二）基于自噬体标记蛋白 LC3 的检测方法自噬过程由一系列自噬相关蛋白（ Atg 蛋白）介导完成，这些蛋白质在自噬体形成的不同阶段发挥作用。 微管相关蛋白 1 轻链 3 （ microtubule-associated protein 1 light chain3,LC3/Atg8 ）是自噬体膜上的标记蛋白。细胞内存在两种形式的 LC3 蛋白： LC3-1 和LC3- II。LC3蛋白在合成后其C端即被Atg4蛋白幅切割变成LC3- I , LC3- I散在分布 丁细胞浆内。当自噬体形成后，LC3
9、-1和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine, PE偶联形成LC3-皿并定位丁自噬体内膜和外膜。与其他一些定位丁自噬性结构膜上的Atg蛋白不同（仅在自噬过程的某一阶段发挥作用），LC3-H始终稳定地保留在自噬体膜上 直到与溶幅体融合，因此被用来作为自噬体的标记，且LC3-H的水平在某种程度上反映了自噬体的数量5（三） 基于自噬性降解的检测一一 “自噬潮”分析自噬过程是动态变化的，而自噬体仅是整个自噬通路过程中的一个中间结构。要说明细胞自噬活性的强弱，必须通观整个自噬的过程是否顺利，即通过基丁自噬性降解的自噬潮（autophagic flux ）分析来进一步说明自噬活性。
10、目噬潮是一个动态连续的概念，涵盖了自噬体的形成、自噬性底物向溶酶体的运送以及在溶酶体内降解的整个过程。显 然，对这整个过 程进行监测较单纯自噬体检测更能反映自噬活性，因此“自噬潮”分析是反映自噬活性的可靠指标6 o（四）自噬的实验性调控通过人为的干预来激活或者抑制自噬功能后观察细胞行为或效应分子的变化能够使研究结论更具有说服力。目前，实验性激活或者抑制自噬的方法有药物处理、自噬基因敲除、沉默或过表达。常用的抑制自噬及诱导自噬的药物及机制如表1所小。这些工具药普遍存在的缺陷就是特异性不强，在抑制自噬的同时对细胞其他代谢过程也可能会有影响。如3-MA抑制Classi PI3K的同时对Classi
11、PI3K同样也有抑制作用，继而抑 制 Akt/mTOR通路，激活自噬。表1常用的口噬抑削剂林)自曜澈精剂lable 1 Inlubitor and Ktivator of autopluig )自哩押制制咪春花HLhafllMnydn AI P1抻 W C lais Ml P13K.圳：日您侏 FF,以棒凯hRZ体与辞Ni仕的融由抑站序凰体融化chTOR 土S*椅.抑神31巧单档时的1块=：皆成冉亢#酷3 Rtaillomj-cm AIL K(kflr - KfifcFMdl pep staiin 4乏什。科权酸址乏 i一*盅舟政其？=匚枕 C 口 网、Tiirinl ffl PP24J, U
12、thuiii14ABT门仲“和 KmaLL- nLd$uJccl rHpaiiytanA不明LC3（五）体内自噬分析体内自噬分析的策略有三种：一是传统的基于对组织切片标本进行电镜观察和 蛋白的检测 7 。二是应用 GFP-LC3 转基因小鼠实现体内自噬的实时监测 8 , Tian 等 9 应 用该转基因小鼠，然后借助于体内成像技术经颅骨检测实验性脑卒中后缺血脑组织区域GFP 荧光强度，实验结果与活体外的 Western blot 及荧光免疫组化的结果一致。三是通 过构建自噬相关基因缺失的实验动物， 这为研究自噬在机体水平所发挥的作用并验证体 外试验的结果提供了很好的平台。但是，自噬在体内是随时
13、间不断变化的，要想准确反 映这种变化，必须实现体内自噬活性的实时监控，而仅凭观察到的自噬体出现无法说明 自噬活性的改变。自噬的研究中，首先必须分活形态学和功能学检测的不同，避免将某一特定生理条件下检测到的自噬现象 （或自噬的缺失） 归于自噬功能的改变。其次要活楚当前大部分 自噬检测方法普遍反映的是自噬在某一特定“空间点”的变化，自噬是一个随时间不断 变化的动态过程。因此，用静态的方法去研究动态的过程得出的结论不可避免地存在一定的局限和偏倚。换句话说，我们检测的结果可能并未反映细胞内自噬活性的真正变化 趋势，目前对于自噬在某些生物学过程中所发挥的作用一直没有定论，如在自噬与肿瘤 的研究中，自噬是
14、促进肿瘤还是抑制肿瘤，不同的研究有不同的结论。作者认为，归根结底可能还在于我们对自噬的认识，即自噬检测方法的局限性。任何一种方法单独应用 均不能作为自噬的依据，因此，在对任何一种方法得到的结果进行解释时，必须慎重， 特别是不能仅根据自噬体的增多减少或自噬相关蛋白表达的高低就草率地得出自噬增 强或减弱的结论。实际上，这是目前许多研究忽视的一个重要问题。学术界已经达成的 倾向性共识，建议在选择自噬研究方法及结果解释时需考虑以下问题：a.联合不同检测原理的方法；b.借助不同的检测技术，避免单一技术的局限性；c.形态和功能并举，以形态学检测为基础，注重整个自噬通路的变化；d.体内体外结果互相验证；e.
15、避免将形态学的结果盲目地解释为功能的变化，避免将体外的结果盲目地理解为体内的情 形，以求准确全面地反映自噬在各种生物学过程中的作用 10 。总之，在准确可靠的自噬 功能检测及监控方法问世前，我们还是应该以一个理性的态度去看待不同的研究结论， 更应该慎重地将研究结论应用于临床治疗。工细胞自噬发生的分子机制（一）自噬诱导阶段细胞在能量缺乏、氧化应激、运动刺激或细胞器和蛋白质累积时， 能诱发细胞自噬。经典的诱导途径是通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（ mammalian target of rapamycin,mTOR）与UNC-51样酶（UNC-51 like kinase 1,ULK1 ）复合物之间的作用来实现的。ULK1 复合物主要包括ULK1 （酵母中 Atg1 的同系物）、 FIP200 （酵母中 Atg17 的同系物）和 mAtg13 11 。但对自噬诱导起最直接、最重要作用的是ULK1 。最近发现一种自 噬蛋白 Atg101 ，它能与 mAtg13 结合并防止其降解，还能通过mAtg13 与 ULK1 相互作 用，从而有助于自噬体的形成12 。当能量充足时， m
