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1、第七章 微生物的生长和环境条件第一节 微生物的生长和生长量的测定 一、生长的概念微生物在适宜的环境条件下，不断地吸收营养物质，并且按照自己的代谢方式进行新陈代谢活动。如果同化作用超过异化作用，细胞原生质的量不断增加，体积增大，这时微生物细胞所表现的为生长。生长只表现细胞个体的增大和细胞物质量的增加。细胞的生长是有限度的,当细胞增长到一定程度时,就开始分裂,形成两个基本相似的子细胞,每个子细胞又重复以上的过程,长大分裂。在单细胞微生物中，细胞分裂的结果导致个体数目增加，这就叫做繁殖。对于单细胞的微生物来说，它们的生长往往是通过繁殖表现出来的，实际上是以群体细胞数目的增加来作为生长的标志的。丝状微
2、生物如放线菌，霉菌的生长主要表现为菌丝的伸长和分枝，通常是以菌丝的体积和重量的增长（细胞物质量的增长）来衡量生长。从生长到繁殖是由量变到质变的过程，这一过程就叫做发育。二、微生物生长量的测定微生物生长量的测定可以采取直接测定法测定微生物细胞的数量、菌体的体积或重量。亦可以采用间接法测定，测某种细胞物质的含量（如蛋白质、核酸）或某个代谢产物的强度（如发酵糖产酸的多少）。（一）测定单细胞微生物的数量 1测定总菌数（即总的细胞数量）： 计数板直接测数 使用细菌计数板或血球计数板在显微镜下测定出一定体积中的细菌或酵母菌的数量，再通过换算，求出待测样品中微生物的细胞总数。 染色涂片计数法 取0.01ml
3、的菌悬液放在1cm2 的玻片上，让其干燥，然后固定染色，再置显微镜下计数每一视野中的菌数，算出视野面积，按下列公式即可求出每ml原菌液中的含菌数。 每ml原菌液中的含菌数=视野中的平均菌数1cm2/视野面积100稀释倍数 比浊法 比浊法的原理是利用细菌细胞在溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中测定时所吸收的光线越多（即透过的光线少） 方法是先要测定出一条标准曲线，即将菌液制成不同浊度的稀释液，将此不同浊度的稀释液用光电比色计测出其消光值，再把这各种浊度的稀释液用显微镜直接计数法测出其中的含菌数，以不同浊度的稀释液的消光值作纵坐标，以不同浊度稀释液所含的菌数作横坐标，绘出标准曲线。有了标准曲
4、线，就可以取未知菌液测消光值后通过查此曲线得知未知菌液中的含菌数。此方法在工业发酵中应用较多，因为它快速，节约时间。 上述三种方法所测得的微生物细胞的数量都是总菌数即死的活的细胞都包括在内。2. 测定活菌数微生物活菌数的测定有以下两种方法 稀释平板测数法此法是将待测样品进行十倍稀释，取最后三个稀释度倒平板，进行平板培养，由平板上长出的菌落数求出待测样品中的含菌数，具体方法实验中要做，不详述。注意，现在国际上含菌数表示用Cfu（菌落形成单位）/克来表示。 稀释培养测数法： 该方法的原理是菌液经多次稀释后，菌数逐步减少以至无菌存在。 方法是：将待测菌液于液体中作十倍系列稀释，每稀释度做35个重复，
5、经培养后，检查细菌的生长，以有细菌生长的最后三个稀释度的管数作数量指标，由数理统计表查出近似值，再乘以数量指标第一位的稀释倍数，即为原菌液中的菌数。例如：某细菌在稀释培养法中生长情况如下：稀释度： 103，104，105，106，107，108重复数： 5 5 5 5 5 5有菌生长管数： 5 5 5 4 1 0根据上述结果，数量指标为“541”，查表得近似值为17，乘以第一位数的稀释倍数，得出原始培养物的活菌数=17105个。(3) 薄膜过滤计数法；此法用于计数空气中的含菌数当一定体积的空气通过滤膜后，将滤膜培养后计数滤膜上的菌落数即可求出单位体积空气中的含菌数。（二）测定细胞物质的量 1干
6、重法 取一定体积的培养物，用离心过滤的方法将菌体从培养基中分离出来，洗净，烘干，称重，再求出单位体积中细胞物质的干重，以此作为生长量的指标。2含氮量测定法微生物细胞中蛋白质的含量是比较稳定的，通常是测出微生物细胞中的含N量后再换算出蛋白质的含量。蛋白质的含量=氮量6.25含N量的测定可用凯氏定N法。3. DNA测定法通过测定微生物细胞中DNA的含量，再换算出微生物细胞的数量。例如细菌，平均每个含DNA的量为8.4105 g，若测得某样品中的DNA含量为8.410-2g，则测定样品中含有1000个细菌。DNA的含量测定可用紫外线吸收法。第二节 细菌纯培养的生长 一、生长曲线 将少量细菌的纯培养体
7、接种到新鲜的液体培养基中，定期测定菌体数量，开始时生长缓慢，然后细菌数目以对数增加，继而稳定在最高生长量上，最后逐渐降低，进入衰老死亡阶段，如用座标法作图，以时间为横座标，以菌数的对数增长量为纵座标，可以绘出一条曲线，我们将此曲线叫做细菌纯培养的生长曲线。菌数时间 滞留期 对数期 稳定期 衰亡期 细菌纯培养的生长曲线可分为四个时期：（1）滞留适应期，（2）对数生长期，（3）稳定生长期，（4）衰亡期 （一）滞留适应期菌种初接入新鲜培养液内，并不立即生长繁殖，而需要通过自身生理机能的调节以逐步适应新环境，因此在开始一段时间，细胞数量几乎不增加，群体的生长率近于零，曲线平缓。 在这个时期内,菌体体积
8、增长较快,如巨大芽孢杆菌可以从3.4m增长到9.119.8m。细胞内原生质比较均匀一致，贮藏物质消耗，DNA含量提高，产生各种诱导酶，在这个时期的后阶段，菌体细胞逐步进入生理活跃期，少量菌体开始分裂，曲线稍有上升。滞留期的长短，因菌种和培养条件不同而异，几分钟到几小时不等。不同微生物的适应期不同，如大肠杆菌的滞留期就较分枝杆菌短。同一菌种，接种时所处的生长发育期不同，滞留适应期的长短也不一样。如果接种用的菌种正处于生理活跃时期，营养和环境条件都适宜，滞留适应期将显著缩短。 （二）对数生长期滞留期末，细胞开始出现分裂，培养液中的菌数增加开始进入对数生长期，在此期中，以细菌数的对数与培养时间作图则
9、成一条斜度很小的直线。 在对数生长期内，细菌数目的增加是按几何级数增加的，即1 2 4 8亦即20 21 22 232n这里的指数n为细菌分裂的次数或者增殖的代数，也就是一个细菌繁殖n代产生2n个细菌。如果在对数期开始时间t1的菌数为x1，繁殖n代后到对数期后期（t2）的菌数为x2，则代时（G）（即每增加一代所需要的时间）应为：G=（t2t1）/n，先求代数n，由于x2=x12n，lgx2=lgx1+nlg2，n=（lgx2lgx1）/lg2lg2=0.301n=3.301lg(x2/x1)即G=（t2t1）/3.31lg(x2/x1)例如在一细菌培养液中第一次测得的细菌数为104/ml，经过
10、培养4小时后，又测得菌液中的细菌数为108/ml，求此菌的世代时间和在此时间内繁殖的代数。 根据公式：G=（t2t1）/3.31lg(x2/x1) t2t1=（40）60分=240分 x2= 108 x1=104lg(x2/x1)=lg108lg104 =84=4代入上式 G=240/3.34=240/13.2=18分钟即在上述培养液中，世代时间为18分钟。细菌繁殖的代数n=（t2t1）/G=240/18=13.3代即在上述培养液中，细菌繁殖了13.3代。在对数生长阶段，细菌在一定的条件下，世代时间是相对稳定的，一般细菌的代时多为2030分钟，也有更短一些的，也有更长一些的。代时愈短表示细菌分
11、裂的愈快，代时愈长，表示细菌分裂的愈慢。例如大肠杆菌在世代时间不同的情况下染色体复制及细胞分裂的配合模式图如下：细胞周期（分钟） 0 10 20 30 40 50 60世代 时间（分钟）60 504030 上图说明在60分钟为一个世代时间的正常生长速率的大肠杆菌中，DNA的合成约需要40分钟，细胞分裂需要20分钟。DNA复制完成后，细胞开始分裂。若细菌生长速度加快，世代时间缩短，则DNA的复制与细胞分裂交叉进行，即在刚分裂的子细胞中DNA已经进行了复制。若细菌生长速度比正常生长速率慢，则DNA复制的时间超过40分钟，但所需时间仍只需要一个世代时间的2/3。（三）稳定生长期微生物经过对数期的旺盛
12、生长，周围环境发生了一系列的变化某些营养物质消耗，有害代谢产物积累，pH，Eh，温度改变限制了菌体细胞继续以高速度进行生长和分裂。新细胞的增加与老细胞的死亡几乎相等。此期称为稳定生长期。 此期的特点是：开始细菌分裂间隔时间延长，曲线上升缓慢，随后新生细胞与死亡细胞的速率处于动态平衡，菌数达到最高水平，随后细胞死亡速度超过新生速度，曲线开始下降。 （四）衰亡期 稳定期后由于环境条件进一步恶化，如再继续培养，细菌死亡速率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活菌数按几何级数下降，故有人称为“对数死亡阶段”。 在衰亡期，有的细胞开始自溶，产生或释放出一些产物，如aa、抗生素、转化酶、短肽酶等。菌
13、体形状呈多形态，大小不一，甚至畸形，细胞质内多液泡，有些G+变为G。 微生物的生长曲线反应一种微生物在一定的生活环境中（如试管、摇瓶、发酵罐）的生长繁殖和死亡规律，它既可作为营养和环境因素的理论指标，也可作为调控微生物生长发育的依据，指导微生物的生产实践。二、连续培养当微生物在一个固定的容器中生长时，由于养料的消耗，代谢产物的积累，必然会导致微生物生长速度减慢，为了保持微生物能长时期的处于对数生长期，就要采用连续培养，即在一个恒定容积的流动系统中，一方面以一定的速度不断地加入新的培养基，另一方面又以相同的速度流出培养物，这样就可以使容器中微生物的数量和营养状态保持恒定，使微生物长期处于旺盛生长
14、阶段。连续培养的方法主要有两类： 1恒浊连续培养：不断调节流速使细菌培养液浊度保持恒定的连续培养方法叫恒浊连续培养。即使培养物的浓度保持恒定。 2恒化连续培养：控制恒定的流速，使由于细菌生长而耗去的营养物及时得到补充，培养容器中营养物浓度基本恒定，从而保持细菌的恒定生长速率，故称恒化连续培养。即使新鲜培养物的加入量恒定。 三、同步培养： 为了特殊的研究目的，有时需要许多微生物的细胞来自同一生长阶段，为此人们发展了微生物单细胞的同步培养技术。 同步培养法是：能使培养的微生物处于比较一致的生长发育阶段上的培养方法叫同步培养法。同步生长：利用同步培养技术控制细胞的生长，使微生物细胞处于同一生长阶段，所有的细胞都能同时分裂，这种生长方式叫同步生长。用同步培养法获得的培养物叫同步培养物。同步培养法有如下几种： 离心沉降法 选择法 过滤分离法 将不同大小细胞分开培养 硝酸纤维薄膜法同步培养法 温度调整法 沙门氏菌25只合成细胞 诱导法 物质，37细胞进行分裂
