Fc融合蛋白应用前沿

《Fc融合蛋白应用前沿》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Fc融合蛋白应用前沿（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、Fc融合蛋白应用前沿Fc 融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有生物活性的功能 蛋白分子与 Fc 片段融合而产生的新型重组蛋白，其不仅保留了功能蛋 白分子的生物学活性，还具有一些抗体的性质，如通过结合相关 Fc 受 体延长半衰期和引发抗体依赖细胞介导的细胞毒性效应等。抗体类药物是当前药物研发的重点和热点，通常能较快获得上市 许可，并带来较大的商业成功。进入21 世纪以来，美国 FDA 和欧洲 药物管理局(European Medicines Agency , EMA )总共批准了约 20 种抗体类药物。借助传统抗体的成功平台，一种基于抗体结构，将 蛋白或多肽与免疫球蛋白 Fc 片段相融合的新

2、功能重组蛋白也获得了一 定的发展。Fc 融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有生物学活性的功 能蛋白分子与Fc片段融合而产生的新型蛋白，功能蛋白可以是能结合 内源性受体(或配体)的可溶性配体(或受体)分子或其他需要延长 半衰期的活性物质(如细胞因子)。该类融合蛋白不仅保留了功能蛋 白分子的生物学活性，并且还具有一些抗体的性质，如长效半衰期。 例如，普通重组IL-2体内半衰期仅为6.9 min，而重组IL-2/Fc融合 蛋白体内循环半衰期则延长了近700倍。1 Fc融合蛋白的类别根据是否需要发挥Fc段结合FcyR来介导抗体依赖细胞介导的细 胞毒性( antibody-dependentcell

3、-mediated cytotoxicity，ADCC) 或结合补体C1q来介导补体依赖的细胞毒性(complement- dependent cytotoxicity, CDC )等的生物学活性，可将Fc融合蛋白 分为溶细胞性(cyto-lytic )和非溶细胞性(non-lytic )。前者由功能 性蛋白与天然或活性提高的 Fc 片段融合而成，不仅具有功能蛋白的生 物学活性和长效血浆半衰期，并且保留了 Fc段介导ADCC及CDC 效 应的能力，可以靶向杀伤功能蛋白受体阳性细胞。在抗体应用领域， 尤其是具有抗肿瘤活性的抗体，通过优化 Fc 段氨基酸组成或糖基化模 式等，从而加强由其介导的 A

4、DCC、CDC 等细胞毒活性的研究已经成 为一个热点。非溶细胞性融合蛋白由功能性蛋白与活性降低的Fc片段融合，通 过对 Fc 片段上补体受体结合域或糖基化模式的突变改造，调节 Fc 与 相关受体的结合亲和力，降低或消除 ADCC 和 CDC 效应，只保留功 能蛋白的生物学活性和 Fc 段长效体内半衰期，而不产生细胞毒性。例 如，研究者利用IgD和IgG4组成的杂合Fc( hybrid Fc，hyFc )与 促红细胞生成素(erythropoietin , EPO融合，构建不能结合FcyR I 和C1q，无细胞毒性的长效EPO-hyFc分子，其半衰期达到了重组人 EPO阿法达贝泊汀(darbep

5、oetin alfa )的2倍。Vafa等通过氨基酸替换，微调蛋白三级结构，破坏结合FcyR和补体的活性，构建能 够完全消除免疫效应功能，但能够正常结合新生儿Fc受体(neo natal Fc receptor, FcRn )，保持比IgG2更长循环血浆半衰期的IgG2-Fc 突变体。Hristodorov等通过比较6种去糖基化的hIgG单抗和它们的 糖基化物的理化性质和抗原结合力等，发现去糖基化的 IgG 1单抗具有 与糖基化物相似的功能，并且由于前者引发免疫效应的能力降低，从 而更适用于作为治疗慢性疾病药物的融合伴侣。2 Fc融合蛋白理化性质和生物学活性的影响因素Fc 融合蛋白的 2 个组

6、成部分，通常具有相对独立的结构域和功能， 能够从不同的角度影响该类分子的理化性质和生物学活性。2.1 Fc结构域Fc融合蛋白的重要特点是包含Fc片段，同时，这也是影响其理化 性质和生物学活性的关键因素。抗体类药物往往具有较长的血浆半衰期，人体内源性免疫球蛋白 在FcRn的保护下，血浆半衰期能达到19 do Fc融合蛋白含有的Fc 片段也能够通过类似的原理延长其半衰期，即 Fc 片段通过 CH2-CH3 与FcRn结合并呈pH依赖性：在pH 7.4的生理条件下，FcRn与Fc 不结合；在细胞内涵体 pH 6.06.5的酸性条件下，两者结合，从而避 免融合分子在细胞内被溶酶体等快速降解。同时，融合

7、Fc片段能够增 大分子体积，降低肾清除率。当然，还可以通过基因工程手段对Fc段 的氨基酸序列进行突变，获得半衰期更长的突变型融合蛋白。如阿斯 利康的Motavizumab-YTE突变体的Fc段包含了 3个突变：“YTE”， 即252、254和256位的蛋氨酸（Met，M）、丝氨酸（Ser，S ）和 苏氨酸（Thr，T ）分别被酪氨酸（Tyr，Y）、T和谷氨酸（Glu,E） 替换，1期临床研究证实本品在健康人体内的血浆半衰期达到100 d , 约为Motavizumab原型的24倍，而清除率仅为原型的71%86%。“YTE”这一突变技术将有望应用于其他抗体的优化，从而提高半衰期， 减少给药频率。

8、除了长效性，Fc片段还能提高分子的稳定性。Fc融合蛋白可以通 过 Fc 铰链区的二硫键连接形成稳定的二聚体，进一步通过对二硫键的 基因工程改造和修饰，还可以使Fc融合蛋白聚集成六聚体复合物。Fc 区域可以独立折叠，保证伴侣分子体内外的稳定性。研究发现，与 Fc 进行融合能够提高蛋白在哺乳动物细胞内的表达，另一方面 Fc 片段可 以与Protein A亲和柱特异性结合，简化Fc融合蛋白的纯化步骤，这 在相关生物制品的研发过程中具有重要的意义。不同Fc片段能够特异性地结合体内相关Fc受体（FcR）,并发挥 相应的生物学功能（见表1）,Fc片段结合FcR发挥的生物学功能主 要有以下 3类。1）结合免

9、疫细胞表面的激活性或抑制性受体，正向或负向调节免 疫反应。激活性受体（如FcyR 口 A等）的胞浆区含有免疫受体酪氨 酸活化基序（immunoreceptortyrosine-based activation motifs , ITAM ），而抑制性受体（如FcyRUB等）胞浆区则含有抑制性基序（immunoreceptor tyrosine-basedinhibitory motifs , ITIM ） ，分 别起到活化和抑制免疫效应的作用。2 ）作为免疫复合物一部分，协助免疫细胞摄取抗原。如FcyR介 导的抗原摄取能够加强树突状细胞递呈抗原和激活 CD4+ 和 CD8+ T 细胞的能力。3

10、 ）参与免疫球蛋白的运输，如IgG与FcRn的结合。E除刘II 腆.中 ?1II Hir*：Pel RIIAttW)2.2功能蛋白虽然对 Fc 片段的改造会影响 Fc 融合蛋白的理化性质和生物学活性，但其药理活性还是主要取决于功能蛋白部分。功能蛋白应能特异 性地结合某个靶点分子。例如，能够结合肿瘤坏死因子（TNF）并拮 抗其作用的上市药物有：TNF全长抗体（如infliximab、 adalimumab 和 golimumab），PEG 修饰的 Fab （如 certolizumab pegol）和TNFR-Fc融合蛋白（如etanercept ）。靶点为VEGF的药 物有：VEGF人源化抗体

11、（如bevacizumab），衍生自bevacizumab 的 Fab （如 ranibizumab ）和 VEGFR-Fc 融合蛋白（如 aflibercept ）。 此外，人抗白介素-邛单克隆抗体（如canakinumab ）、重组IL-1R （如 anakinra ）和 IL-1R/Fc 融合蛋白（如 rinolacept）均能与 IL-1 相结合。对功能蛋白性质的优化，也将对整个融合分子产生积极影响。胰 高血糖素样肽 -1 （ GLP-1 ）可通过多种机制明显改善 2 型糖尿病患者 血糖情况，但是内源性GLP-1极易被体内的二肽基肽酶-IV（ DPP-IV ） 降解，血浆半衰期不足2

12、min，必须持续静脉滴注或皮下注射才能产 生疗效，大大限制了其临床应用。礼来公司新研发的 GLP-1/Fc 融合蛋白dulaglutide，通过融合hIgG4-Fc达到降低免疫原性、减少肾清除率和延长半衰期的目的，同时还将 GLP-1 改造为耐受 DPP-IV 的 GLP-1 酰胺类似物，在保证活性的前提下，进一步提高了分子的稳 定性。3 Fc融合蛋白类药物1989年，Capon等首次在自然（Nature ）上报了一种能够 结合HIV囊膜蛋白gp120,阻碍HIV-1感染T细胞和单核细胞的 CD4-FC融合蛋白，此后，基于抗体Fc段的Fc融合蛋白的研究和开发 在世界范围内得到了迅速的发展。3.

13、1已上市药物2012年，阿达木单抗（通用名：adalimumab，商品名： Humira ）、英夫利昔单抗（通用名：infliximab，商品名： Remicade ）和依那西普（通用名:etanercept，商品名:Enbrel） 这 3 种治疗自身免疫性疾病的抗体类药物分别以 92.65、82.15 和 79.63 亿美元的全球销售额荣登当年最畅销药品榜单前三甲。作为最 成功的 Fc 融合蛋白药物， Enbrel 在 2013 年的全球销售额也达到了 46.81亿美元，超过了除Humira之外的其他单抗类药物。目前，由 FDA 批准上市的 Fc 融合蛋白类药物主要有7 种（见表 2），均由

14、重组内源性多肽或其突变体与 Fc 片段融合而成，大多数涉 及自身免疫性疾病的治疗；在表达方式上，除了 romiplostim 由大肠 杆菌进行原核表达，其余均由哺乳动物细胞表达。由于原核表达缺少 真核转录后的蛋白修饰过程，酵母、昆虫和植物细胞表达系统的转录 后加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同，且表达的蛋白在糖链的 结构和组分上与哺乳动物表达系统表达的蛋白有所差异。鉴于糖基化 作用对于抗体类药物的重要意义，为了获得蛋白折叠、理化性质和生 物学活性等方面更接近于天然状态的的蛋白分子，利用哺乳动物细胞 表达Fc融合蛋白已经成为一种趋势。农2 FDA批准的Fc址汁贷白处药鞫able 2 Fc fu

15、sion protei n therape； Etar agents approved by FDAEylcrsTEfiF鱼14胞外直-Fc奁仃慣白2011酬1.甜|站贸训：*6ReEffneronXulfiJL*2*11gW时凳屿直宝AfwlxitIL-IK歴肋蛋和勺尺融會蛋flamfr料丹讪聲自-周妣粽音征8-6和a.l幄凱彷柢生战蹴爱律-Fr息件Sir 124m烬it党腿杵飢小駅眩少柞!ft Ml35瓷遥/詳増OrenelaC1W-1胞外区-氐観合置白2005性f懺16頁討黄巅贸宝AneviveUAT枪外区-F帥；贲I2-m餐鬥冈抉世闵科純uWrf-y ji z-rc-p3.2临床在研药物除了已经上市的 Fc 融合蛋白类药物，目前还有很多在研药物已经进入了口期和皿期临床研究阶段（见表3）。衣3已迟人E或m期粘床硏纯的Ft：雜皆査白序药搐Tabh 3 Fc fyslon protein tlierapcLitlc agents in Phase U/HI studies适瞬atariceptIKl-tr莊皆煽白納叫：.ii II；分Merck SeiooiQtTetHman i bAn.-1卿Ane2錯合吐-Fc碾合蛍白即堰絲空i f解增Factor VIII-Fc11RI jF -Fc Ittifirffi AA 和fc加Bioeen Ideei