《13DNA的复制和修复》由会员分享，可在线阅读，更多相关《13DNA的复制和修复（16页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第十三章DNA的复制和修复生物体的遗传信息储存DNA中，并通过DNA的复制由亲代传给子代。在子代的生长发育中遗传信DN自专录给 RNA然后翻译成蛋白质以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。1958年，FCrick提出中心法则：（1）以原DNA分子为模板，合成出相DNA分子的过程。（2）以某一段）NA分子为模板，合成出与其序列对应的A分子的过程。（3）以m RNA为模板，根i三联密码规则，合成对应蛋白质的过程。中心法则揭示了生物体内遗传信息的传递方向。图DNA生物合成有两种方式DNA复制和反转录DNA体内复制涉及原核、真核生物的染色体细菌质粒（环状，双链）真核细胞器）NA（线粒体
2、、叶绿体）病毒（双 链，环状）DNA的体外复制：分子克隆第一节 DNA的复制DNA半保留复制1953年，Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时就推DNA可能按照半保留机制进行自我复制。P321图191 Watson和 Crick提出的DNA双螺旋复制模型在复制过程中，首先亲代双I解开，然后每条链作为模板在其上合成互补的子代链吉果新形成的两个子代NA与亲 代DNA分子的碱基顺序完全一样，而且每个子NA分子中有一条链完全来自亲DNA另一条是新合成的。1958年，Meselsoi和Stahl用15N标记E.coli. DNA证明了DNA的复制是半保留复制。P322图19-2 DNA的半
3、保留复制。1963年，Cairns用放射自显影法在显微镜下首次观察到完整的正在复制的li.染色体DNA。P323 图 19-33H-脱氧胸苷标iE.coli. DNA经过将近两代时间用溶菌酶消化细胞壁将E.coli. DNA专至膜上，干燥，压感光胶 3H放出0粒子，还原银，光学显微镜下观察。用这种方法证明了大肠杆菌染色体是一个环状分子，并以半保留的形 式进行复制。DNA的半保留复制可以说DNA在代谢上的稳定性经过多代复制,DNA的多核苷酸链仍可以保持完8并存在于后 代而不被分解掉。二、复制起点、单位和方向DNA的复制是在起始阶段行控制的，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完成复制。1、
4、复制起点复制起点是以一条链为模板起始Na合成的一段序列。有时，两条链的复制起点并不总是在同一点上（复制）在一个完整的细胞周期中，每一个复制起点只使用一次，完成一次复制过程。多数生物的复制起点，都DNA呼吸作用强烈（甲醛变性实验）的区段，即经常开放的区段A.富含环状DNA复制起点的确定方法P325 图 19-6复制起点的克隆和功能分析重组质粒转化法大肠杆菌的复制起点riC区1Kb的重组质粒在转化子中的复制行为与其染色体一样，受到严密控制，每个细胞只有 个拷贝，用核酸外切酶缩短iC克隆片段的大小，最后得245bp的基本功能区，携带它的质粒依然能够自我复制，拷贝数 可以增加至20以上，这说明发动复制
5、的序歹2!5bp的基本功能区，而决定拷贝数的序列在基本功能区之Kb之间。鼠伤寒沙门氏菌的起点位于一段6bp的DNA片段上，与大肠杆菌的复制起始区有同源性，而且有些亲缘关系较远 的细菌，其复制起点在大肠杆菌中亦能起作用。因此，复制起始区的结构可能是很保守的。起始序列含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序列。2、复制单位复制子Replicon） Genome能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点。原核生物的染色体和质粒核生物的细胞貓NA都是环状双链分子它们都是单复子，都在一个固定的起点开始 制，复制方向大多数是双向眇数是单向复制多数是对称复制少数是不对称复（一条链复制后才进行另
6、一条链的复制）环状DNA的复制眼象，称9形复制。真核生物的染色他NA是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个复制子约有Kbp人体细 胞平均每个染色体含有）00个复制子。病毒DNA多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。3、复制方向定点起始，复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。用放射自显影实验判断A的复制方向及速度低放射性H-脱氧胸苷高放射性H-脱氧胸苷a. 单向 rb. 双向等速卜三种结果图形C.双向异速E.coli.的一个温度敏感株在42时，能使DNA在完成复制后不再开始新的复制过程，在25时复制功又能能恢。4、DN
7、A的几种复制方式（1）、直线双向复制单点，双向,T7多点，双向，真核染色DNA、e型复制：环状双链a单向或双向（.coii.）(3)、滚环复制：环状单链A 6174、D环复制：线粒体、叶绿体A(5)、多复制叉复制：第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。在E.coli.富营养时，可采取多复制叉复制方曲.coli.DNA的复制最快可达0Kb/min完全复制需40min富营养时,20min分裂。而真核染色体要-8小时。三、与DNA复制有关的酶及蛋白质因子目前已发现30多种酶及蛋白质因子参DNA复制（一）DNA的聚合反应和聚合酶DNA生物合成5，T，,化学合成，一5，1、DNA聚合反应必备的
8、条件DNA聚合酶DNA模枫反转录时原NA模板）引物（DNA RNA或蛋白质4种dNTP Mg2+2、聚合反应过程及特点总反应式：厂 dAMPnidATPDNA pol .ndGTP +DNA2dGMPn3dCTPMg2+dCMPndTTP4dTMPIP329 图 19-10P330 图 19-11DNA+ (nl+n2+n3+n4 PPi在链的延长过程中，链的游离羟基，对进入的脱氧核核苷三磷酸磷原子发生亲核攻击，生成5-磷酸二酯键, 并脱下焦磷酸。DNA聚合酶的反应特点：以4种dNTP为底物反应需要接受模板的指导，不能催化游离的P的聚合。反应需有引物-羟基存在链生长方向，一3，产物DNA的性质
9、与模板相同3、由DNA聚合酶催化的几种)NA聚合类型P331图19-12(1) 发荚环结构：加入单链NA作为模板和引物3羟基端回折成引物链。(2) 末端延伸聚合：加入双DNA作为模板和引物3末端突出作为模板。(3) 分枝型和切口平移型聚合：加入双链A聚合发生在口或末端单链区。(4) 环形聚合：加入带引物的环DNA作为模板。4、E.coli DNA 聚合酶(1) 、E.coli. DNA pol.lKornberg酶，400 copy/cel)单体酶，分子量09Kd含一个Zn2+每个细胞中含00个DNA poll催化活性：5, - 3,聚合活性3，- 5，外切活性5，- 3，外切活性用蛋白水解酶
10、#DNA poll部分水解可得：大片段Klenow) , 75Kd活性：，-3，聚合活性、3，- 5,外切活性。小片段，36Kd活性：5，- 3,外切活性(只作用于双DNA的碱基配对部分，切修复)Klenow片段的用途：a补齐DNA 3隐缩未端b. 标记DNA片段未端c. cDNA合成第二链d. d DNA测序(2) 、E.coli. DNA PolU (100 copy/cel)单体酶，分子量20Kd催化活性：5, - 3,聚合(活性很低3，- 5,外切可能在DNA的修复中起某中作用。（3）、 E.coli.DNA polll （复制酶,0-20 copy/ceDl寡聚酶，全酶由0种共22个
11、亚基组成,a、 和0三种亚基组成核心酶。P334表10-3DNA polll是合成新链PNA主要的酶，又称复制酶eplicase）Polin的5, -3,外切酶活性只作用于单DNA。P334 表19-2 E.coli三种DNA聚合酶的性质比较DNA聚合酶有6个结合位W模板DNA结合位点引物结合位点引物3, -OH位点、反应位点底物dNTP结合位点（5） 5，- 3,外切位点pol.II没有 3, - 5,外切位点校正）5、真核生物DNA聚合酶P334表19-4真核生物DNA聚合酶真核DNA聚合酶一般不具备外切活力，可能由另外的1酶在复制中起校正功能。DNA聚合酶！，多亚基,功能与E.coli.
12、 polll类似，是真杨NA复制酶。DNA聚合郵，主要在DNA损伤的修复中起作用。DNA聚合酶，从线住体得到，可能与线粒DNA的复制有关。DNA聚合酶5 ,特点有3，- 5,外切活力。（二）引物酶或RNA聚合酶（引发酶）细胞内，DNA的复制需要引物 （DNA或RNA）,弓I物1或RNA聚合酶可合成-10个碱基的RNA引物。 DNA复制为什么要用NA引物？（为什么NA聚合酶要用引物RNA聚合酶不需要引物？）P338从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链聚合酶的5, -3,校对功能难发挥作用。（三）解螺旋酶大肠杆菌的解螺旋酶I、i
13、i、in与蛋白共同作用，将na两条链解开。解螺旋酶、II、III沿着模板链的 -3方向随着复制叉的前进而移动hep蛋白则在另一条模板链上沿一5方 向移动。（四）DNA旋转酶属DNA拓扑异构酶II,可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。 拓扑异构酶分两类I和II广泛存在于原核生物和真核生物。拓扑异构酶使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无须供给能量，主要集中在活性转录区，与转录有关。拓扑异构酶II使）NA的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要P供给能量。分布在染色质骨架蛋白和 核基质部，与复制有关。（五）单链DNA结合蛋白SSB）复制叉上的解螺旋酶，沿双DNA前进，产生单链区
14、，大量的单NA结合蛋白与单链区结合，阻止复性和保护单链 DNA不被核酸酶降解。（六）DNA连接酶（ligase）连接双链DNA上的切口。大肠杆菌连接酶只能在模板上连接A缺口。TDNA ligas即可连接粘性末端的NA又可连接平齐末端的双DNA。E.col和其它细菌的）NA ligas以 NAD为能源，动物细胞噬菌体DNA ligas以 ATP为能源。（七）DNA复制的拓扑结构P338-339四、DNA的半不连续复制P336图19-15DNA的半不连续复制DNA聚合酶催化的方向是一3,。前导链：滞后链：1968年，发现冈崎片段。长度：细菌：1Kb-2Kb相当于一个顺反子的大小。真核：100-20
15、0bp约等于一个核小体NA的长度。五、DNA复制过程Ecoli）P342图19-17大肠杆菌的复制体结构示意图1、复制的起始引发：当DNA的双螺旋解开后，合成NA引物的过程。引发体：引物合成酶与各种蛋白质因子aB dnaG n、d n I）构成的复合体，负责NA引物的合成。引发体沿着模板链T方向移动（与冈崎片段合成方向正好相反,而与复制叉勵的方向相同）移到一定値上 即可引发RNA引物的合成。E.coli.DNA复制原点Dri C由245bp组成，三细3bp重复序列（近,端处）四组9 bp重复序列（另一端处）大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质:DNaA在原点处打开双螺旋DNaB使DNA解旋DNaCDNaB结合在原点所需Hu引物酶DNaG）SSBR
