第一节凝集反应

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1、第一节 凝集反应目的和原理 颗粒性抗原与相应抗体在适当条件下发生友应，出现肉眼可见的凝集小块，称为 直接凝集反应。在操作方法上有玻片法和试管法两种。本试验以细菌与其相应抗体反应为例，掌握玻片法和试管法凝集试验的原理，熟悉其 方法和临床意义。一、玻片凝集试验器材和试剂1 标本任一常见细菌的平板或斜面培养物。2 试剂与细菌对应的诊断血清（可用生理盐水作适当稀释以免发生前带现象）、生理盐水等。3 器材 载玻片、接种环等。步骤和方法1 于洁净载玻片的一端加生理盐水一滴，另一端加诊断血清一滴。2用接种环挑取细菌，分别涂于生理盐水和待检血清中，充分混匀。 3室温下静置数分钟观察结果。结果和评价 生理盐水对

2、照不发生凝集，为均匀混浊的乳状液。在诊断血清中，细菌与相应抗 体反应会出现肉眼可见的凝集块，为阳性结果。如与对照相同则为阴性。本方法为定性试验，敏感性较低。但操作简便，反应迅速，目前仍然是细菌分型 鉴定和 ABO 血型鉴定的常规实验。二、试管凝集试验器材与试剂1标本 待检血清。2 试剂 伤寒沙门菌H诊断菌液（7X108/ml）、抗伤寒沙门菌H抗血清（用生理 盐水做1： 10稀释）、生理盐水。3器材恒温水浴箱、试管架、试管、吸管等。步骤和方法 - 操作程序和加入成分见表 1 1取洁净试管8支，排列于试管架上，依次编号并做好标记。2 向各试管中均加人生理盐水0. 5ml。3 吸取1:10稀释的抗伤

3、寒沙门菌H抗血清0. 5ml,加入第一管中，充分混合，吸出0. 5ml 放人第二管，混合后取出0 5ml于第三管中，如此直至第七管，混匀后吸出0. 5ml弃去。第八管不加血清，为生理盐水对照。至此第 17 管的血清稀释度为： 1： 20、 1 ： 40、 1： 80、 1： 160、 1： 320、 1： 640、 1： 1280。这种稀释方法称为连续倍比（2倍）稀释法， 是免疫学试验中常用的一种稀释方法。4 向每管加入诊断菌液0 5ml,此时每管的液体总量为1. 0ml,血清稀释度又 增加 1 倍。5 摇匀置37C 24h，取出置4C或室湿过夜后观察结果。管号2345678（对照）生理盐水血

4、 清稀释度0.90.50.50.50.50.50.50.50.1：0.50.50.50.50.50.5弃去0.51:101:201:401:80:1:1601:3201:640诊断菌液 0.50.50.50.50.50.50.50.5终稀释度 1:201:401:801:1601:3201:6401:1280表1试管凝集操作程序（单位：ml）结果和评价 判断凝集试验的结果，要有良好的光源和黑暗的背景，先不振摇，观察管底凝集 物和上清的浊度。然后轻轻摇动试管，注意观察凝集颗粒的松软度、大小、均匀度等性状及 液体的混浊程度。1 盐水对照管应无凝集现象，轻轻摇动试管，细菌分散均匀混浊。2 伤寒沙门菌

5、O抗原凝集物呈颗粒状沉于管底，轻摇时不易散开；H抗原凝集 物呈絮状，疏松而大块地沉于管底，轻摇易离散。凝集程度通常以“+”表示强弱。“4+”很强，细菌全部凝集，凝块全沉于管底，液体澄清。 “3+”强，细菌大部分凝集，液体稍混浊。“2+”中等强度，细菌部分凝集，液体较混浊。“+”弱，仅少量细菌凝集，液体混浊。“一”不凝集，液体混浊度与对照管相同。 3 只要待测血清管出现“2+”以上的反应现象，就可判为反应阳性；以出现2+” 凝集的最大血清稀释度为待检血清的抗体效价。 、4本试验是一经典的定量凝集试验，敏感性不高，但操作方法简单，至今仍在使 用。临床意义1主要用于鉴定细菌的种和型。2ABO 血型鉴

6、定。第二节 沉淀反应三、凝胶双扩散试验目的和原理将对应的抗原与抗体放在琼脂凝胶板中的相应孔内，可各自向凝胶中自由扩散。当二者 相遇时发生特异性反应，在浓度比例合适处形成可见的白色沉淀线。根据抗原与抗体的性质 纯度和比例的不同，沉淀线的形状、位置和数量不一。要求掌握试验原理、方法和结果分析，熟悉其临床意义。器材和试剂1试验标本2主要试剂3主要器材步骤和方法待检血清、人IgG血清。羊抗人IgG诊断血清、15g/L盐水琼脂等。 载玻片、吸管、打孔器、湿盒、微量加样器等。1,浇板用粗孔吸管吸取熔化的1.5%盐水琼脂4.5ml,浇注于普通洁净载玻片上，要均匀、平整、无气泡、布满整个玻片。2. 打孔待琼脂

7、凝固后（室温约需1520min），用直径3mm的打孔器打孔，使孔间距 为45mm。临床常用的孔型为梅花形，中间为抗体孔，四周等距排列6个抗原孔。3加样 用微量加样器向中央孔加入抗体（人 IgG 诊断血清），向周围孔加入待测抗原， 其中第15孔加入阳性对照血清（羊抗人IgG诊断血清按1： 2、1： 4、1： 8、1： 16、1： 32 倍数稀释），第 6 孔分别加入待检血清。如用于检测抗体特异性时，中央孔加抗血清，四 周孔加入不同的有关抗原；如进行抗体效价滴定时，则在中央孔加入抗原，四周孔加不同稀 释度的抗血清。4.扩散 将加好样的琼脂板放人湿盒中（内有5%的石炭酸湿纱布），置室温或37C1 2

8、d,于24h和48h各观察和记录结果一次。结果和评价 如果凝胶中出现白色沉淀线，说明抗原与抗体相对应。若抗原与抗体只含单一的对应成 分，则形成一条沉淀线；若含多种对应成分，可形成多条沉淀线。沉淀线的位置因抗原和抗 体的分子量、浓度比例、扩散速度等因素的不同而异。另外，若相邻抗原浓度相等，可出现 对称相融的沉淀线；若不等，沉淀线移向低浓度一边。在梅花孔型中，若相邻两条沉淀线完全融合，说明两孔内抗原完全相同，若相邻沉淀线 部分融合，说明两抗原部分相同；若相邻沉淀线发生交叉，说明两抗原完全不同。阳性结果多在24h以内出现，48h不出现沉淀线可判为阴性结果。放置过久可使沉淀线 消失。此方法简便易行，结

9、果稳定可靠；但灵敏度低，试验所需时间长，且只能定性，不能定 量，仅适用于大量普查项目。四、对流免疫电泳目的和原理 在偏碱性的缓冲环境和适当的直流电场中，大部分抗原带有较多的负电荷，向正 极移动；而抗体（尤其是IgG）在同样的环境中带负电荷较少，加上凝胶内较强的电渗作用， 故抗体向阴极移动。在一定时间内（约3090min）,移动的抗原和相应抗体在两孔间相遇并 发生反应，在浓度比例适当时形成沉淀线：本实验以测定血清中AFP为例，要求掌握实验原理、操作过程和结果分析；熟悉其临 床应用及意义。器材和试剂1. 试验标本阴性血清、人 IgG 血清。2. 主要试剂羊抗人IgG诊断血清、pH8. 6 0. 0

10、5mol / L巴比妥缓冲液、15g /L琼脂巴比妥溶液。3. 主要器材 电泳槽、电泳仪、孔型模板、打孔器、载玻片、吸管、微量加样器、 吸球、滤纸和纱布条等。 一步骤和方法1. 配制试剂 按本书后的附录配制pH8. 6 O. 05mol / L巴比妥缓冲液和15g / L 琼脂巴比妥液并将后者加热熔化。2. 制板用粗孔吸管吸取已熔化好的巴比妥琼脂4. 5ml,加到洁净载玻片上 浇制成琼脂板。3. 打孔待琼脂凝固后成对打孔，孔径为3mm,孔距为10mm。4. 加样（无需稀释）做好抗原（阴性血清、人 IgG 血清）和抗体（羊抗人IgG 诊断血清）的标记（例如在无关紧要的边缘打一小孔等），按标记分别

11、加入抗原、抗体 及阳性对照。5电泳 将加样完毕的琼脂板置电泳槽的支架上，抗原孔置阴极端，抗体孔 置阳极端，电泳槽内加o. 05mol/LpH8. 6的巴比妥缓冲液，液面至槽高的2/3处，琼 脂板两端用滤纸条和纱布条与缓冲液相连。接通电源，控制电压在1012v （3v/cm板宽）。 电泳40min后，切断电源，放置半小时后取出琼脂板观察结果。结果和评价 待测孔与抗血清之间出现沉淀线为阳性，否则为阴性。 阳性结果的沉淀线位置与抗原和抗体分子的电荷情况有关，也与抗原和抗体的比 例有一定关系。对流免疫电泳操作简便，观察结果快，敏感度比琼脂双扩散法高816倍。制作琼脂 板时必须选择高电渗作用的普通琼脂，

12、还要选择高特异性、高亲和力的抗体，否则结果难以 解释。第三节 酶免疫技术五、酶联免疫吸附试验目的和原理酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种固相酶免疫测定技术，先将抗体或抗原包被到某种 固相载体表面，与待测样品中的抗原或抗体发生反应，再加入酶标抗体与免疫复合物结合 最后加人酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度（A）值的大小进行定性或定 量分析。该试验的检测类型有双抗体夹心法、间接法、双位点一步法、竞争法和捕获法等 本试验以间接法为例。要求掌握ELISA的原理、方法和应用。一 试剂器材1. 试剂（1）IX包被缓冲液（2）洗涤缓冲液（3）抗体稀释液（KGP1241、12410、1250）

13、（4）底物缓冲液（PH5.0磷酸棗柠檬酸）：0.2M Na 2 HPO 4 （28.4 克 /L） 25.7ml0.1M柠檬酸（19.2克/L）24.3ml加蒸馏水50ml。（5）显色剂（KGP1251、12510）（6）终止液（KGP1271、12710）二 操作步骤（用于检测未知抗体的间接免疫吸附法）1. 包被：用1X包被缓冲液将抗原（人IgG）稀释200倍至蛋白质含量为lOug/ml。 在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml, 4C过夜。次日，弃去孔内溶液，用1X洗 涤缓冲液洗3次，每次3分钟。2. 加样：加一定稀释的1抗（羊抗人IgG） （1:100,1:500,1:1000）0.1m

14、l于上述已包 被之反应孔中，置37C孵育1小时。然后用1X洗涤缓冲液洗涤。（同时做空白孔，包被时加水；阴性对照孔，包被时加阴性血清；其余步骤相同）。3. 加酶标抗体HRP:将2抗（兔抗羊IgGHRP），于各反应孔中0.1ml。37C孵育1 小时，用IX洗涤缓冲液洗涤。4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液（显色剂）0.1ml, RT, 10分钟。5. 终止反应：于各反应孔中加入中止液0.05ml。（此步骤可省略，如显色反应不明 显再加中止液）6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度 越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“

15、+”、“-”号表示。7. 可测0D值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔0D值， 若大于规定的阴性对照0D值的2.1倍，即为阳性。三 注意事项1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份， 以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或 BSA等封闭。2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括：（1）固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺 和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。 不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观 察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。（2）包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要 好，吸附时一般要求PH在9.09.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量