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1、谈谈生物药物分析方法 现状与发展趋势药物制剂 0301 许敏华 3031901053 摘要：本文对生物药物分析方法进行了较全面的阐述，并对近年来生物药物分析的新方法、新技术的进展及应用前景进行探讨。 关键词：生物药物 分析 生物药物包括直接从生物体分离纯化所得生化药物及利用基因重组技术或其它生物技术研制的生物技术药物及生物制品1。由于生物药物具有毒性低、副作用小、易被吸收的特点，同时具有多方面的生物活性及功能，在疾病的预防、诊断及治疗方面有着突出贡献。随着人们对生命本质及身体健康的日益关注，生物药物的研究和开发日趋增加，控制生物药物的质量，加强药物分析检测技术日益受到重视。本文将对用于生物药物
2、的鉴别、检查和含量测定的方法进行分析比较，并对近年来生物药物分析的新方法、新技术的进展及应用前景进行探讨。 一生物药物分析方法 生物药物分析主要包括化学方法、仪器分析方法和生物检定法。 1化学法 化学法包括重量法和滴定法 重量法：指待测物经处理后分离出与待测组分相关的单质或化合物，根据其质量，确定该组分的含量。硫酸软骨素的测定及胰酶中脂肪含量的测定均采用重量法2。 滴定法：指利用化学反应定量关系，根据消耗标准溶液的体积确定待测物的含量。目前滴定法在我国药典中仍占有一定的比例，氨基酸类和糖类药物多用滴定方法进行含量测定3。 化学方法主要用于常量分析，准确度较高，但操作繁琐，耗时较长，不利于实现自
3、动化，在药典及近年来的研究中有所下降。而仪器分析方法的研究、应用与改进则是生物药物分析的热点。 2仪器分析方法 仪器分析方法用于微量和痕量分析，灵敏度较高。主要包括光学法、电化学法、色谱法、电泳法、酶法、免疫法。 21 光学法 在生物药物分析中常用的光学分析方法有：紫外/可见分光光度法、荧光法、红外吸收分光光度法、核磁共振、质谱等。 紫外/可见分光光度法：主要是利用生物大分子中的某些基团对特定波长具有光吸收作用或某些特殊基团可与某些化学试剂反应生成稳定的颜色，根据吸收光的波长及强度对物质进行定性定量分析。紫外/可见分光光度法由于其设备简单，价格低廉，操作方便易于普及等特点在药物分析中应用很广泛
4、。测定的药物涉及蛋白质多肽类、酶类、抗生素、维生素及嘌啉类药物的测定4，5。但紫外/可见分光光度法灵敏度不高，一般可达 104107g/mL。 荧光法：利用某些基团在吸收了能量以后能够发射出一定波长的荧光等性质，对物质进行定性定量分析。近年来镧系敏化发光的方法在对氨基酸、肽类、蛋白质、核酸、核苷酸、脱氧核苷酸等的分析及药代动力学的研究中应用较为广泛6。荧光法灵敏、准确、选择性好、荧光特性参数多，动态线性范围宽、灵敏度比分光光度法高 24 个数量级，对微量和痕量药物进行灵敏准确的检测具有较大的优越性。激光诱导荧光光谱的灵敏度已达 1022g，实现了检测单个分子的水平，可用于癌症的早期诊断7。荧光
5、法作为一种高灵敏的分析手段，与其它技术相结合，有着更广阔的发展前景。 红外光谱法在我国药典中主要用于生物药物的鉴别和活性成分的分析，目前近红外光谱法是红外分析研究的热点，它具有光谱信息量大，稳定性及重复性好，不需样品制备，无化学废料污染等优点，在药品生产过程中可全面监控整个生产周期的产品质量，在 21 世纪有很好的应用前景7,8。 核磁共振波谱是测定生物大分子结构的有力手段，二维及三维核磁共振波谱仪应用于生物工程中蛋白质的三维结构分析7。质谱法用于对基因工程药物多肽、蛋白质、核酸等的分子量测定及结构和序列的证实9。 22 色谱法 色谱法是利用物理或物理化学性质对混合物进行分离分析的方法。 薄层
6、色谱法是药物色谱领域中的重要分支之一，是一种定性和半定量的方法，在自动化程度、分辨率及重现性等方面不如气相色谱法和高效液相色谱法。薄层色谱法主要用于药物的鉴别、杂质检测，如氨基酸类药物（丝氨酸、亮氨酸和甘氨酸）、酶类（抑肽酶）、蛋白质多肽类（杆菌肽） 、嘌呤类（硫唑嘌呤、巯嘌呤）的鉴别等10，11。近年来薄层色谱法大力加强标准化、仪器化和自动化改进，如应用自动点样仪，自动程序多次展开仪，薄层扫描仪等，引入强制流动技术，使薄层色谱法的重现性、准确度和精密度有大幅度提高7。 气相色谱法（GC） ：对含有挥发性成分的药物，气相色谱仪是常用的分析工具。美国药典中氨基酸等药物中有机挥发性杂质的检查采用气
7、相色谱法。在药品中残留的有机溶剂的毒性和致癌作用日益引起人们的重视，用气相色谱测定药品中有机溶剂的残留量也是目前值得重视的研究方向。采用 GC-MS-SIM可测定药物浓度至 1091012g/mL的体液样品7，在体内药物分析、药物动力学研究等方面具有较强的优势。 高效液相色谱法（HPLC）：HPLC具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点，在目前生物药物的鉴别、检查和含量分析中占有重要地位12。随着衍生化技术的发展，改善了被测物的检测特性，提高检测灵敏度，使HPLC已广泛用于氨基酸的分析13；HPLC也是蛋白质结构和纯度分析的重要工具，英国药典和美国药典对胰岛素的鉴别和效价测定及其中相关蛋白的限量
8、测定均采用HPLC方法，我国药典中HPLC仅用于鉴别；对于嘌呤类药物甲氨喋呤与叶酸以及糖类药物美国也多已应用HPLC进行含量分析。近年来由于检测器的发展，如蒸发光散射检测器的应用拓展了对无近紫外吸收的药物的分析，二极管阵列检测器、荧光检测器的应用提供了一种快速有效的高灵敏度的方法。 HPLC采用蒸发光散射检测器直接检测非衍生化的氨基酸8，配合HPLC的分离定量，检测限达到了ng 级，回收率为 94。液相色谱与质谱的联用在生物大分子、体内药物代谢和临床药物检测中应用日益增多，多维色谱LC-LC-MS,LC-LC-LC-LC-MS-MS等用于药物、蛋白质、多肽结构测定，并使整个操作完全自动化，是
9、21 世纪色谱分析的发展方向之一。微柱液相色谱由于分析所学的样品用量及流动相的消耗大大下降，检测灵敏度大幅度提高，具有广阔的发展前景。 超临界流体色谱法（SFC）:是以超临界流体作流动相进行分析的一种色谱技术，适用于热稳定性差、极性大和挥发性小的药物分析，是GC和HPLC的重要补充技术。SFC在分析激素、抗菌素和依赖性药物时，只用CO2作流动相就将结构相近的物质分开，并用于尿中咖啡因和激素的测定，在分析一个含多个极性基团，分子量达 440的抗菌素时不需衍生化，可直接进样分析14；Bargman等用SFC研究一系列选光性的阻抗剂的分离与分析，以分子模型为基础，提出了手性识别机理。由于超临界流体色
10、谱法不用或很少用有机溶剂，是一种符合环保要求的分析方法。 23 电泳法 电泳法是一种以动电现象为基础的物理化学分离分析方法，是生物物质分离分析常用方法。醋酸纤维薄膜电泳用于常规血清蛋白、脂蛋白的分离和定量测定；聚丙稀酰胺凝胶电泳用于胰岛素有关蛋白质的检查、基因工程药物DNA的分离回收；琼脂糖凝胶电泳具有较大的凝胶孔径，特别适合于分离和鉴别核酸和核蛋白2。 高效毛细管电泳（HPCE）是近年来发展迅速的新型分离分析方法，在生物大分子的分析方面具有许多优势15,16。根据分离模式分为：毛细管区带电泳（CZE）基于各被分离物质的净电荷与质量比之间的差异，不同离子按各自表面电荷密度的差异，以不同的速度在
11、电解质中移动而致分离。适用于蛋白质、氨基酸、肽、对映体的分析，胶束电动毛细管色谱（MECC）通过将离子表面活性剂加入电解质溶液，形成胶束，使溶质在胶束相和水相之间分配，将分配与电动相结合，不仅能分离离子型物质，也能分离电中性物质；毛细管等电聚焦电泳 （CIEF）将传统的等电聚焦过程移到毛细管内进行，多用于蛋白质，肽类物质的分析。毛细管凝胶电泳(CGE)是以凝胶作支持物进行的区带电泳可分离测定蛋白质和DNA等大分子化合物。 毛细管电色谱(CEC)，多用于水溶性差的物质和水中难进行反应的物质的分析。 高效毛细管电泳兼有电泳和色谱技术的双重优点，对基因工程药物的分析具有高效、低耗、快速、灵敏等特点，
12、随着各种不同的预浓缩技术、堆积技术、场放大技术、固相预柱等技术以及新分离模式毛细管电色谱等的应用7,13，仪器的不断改进，高效毛细管电泳将成为生物药物分析的重要工具。 24 电化学法 电化学法是利用物质电化学性质根据电参量的大小确定待测物含量的分析方法。电位滴定法仍是氨基酸和嘌啉类药物的常用分析方法2。目前微电极、超微电极、化学修饰电极的研究和应用是电化学分析领域中较为活跃的研究方向，如用聚吲哚乙酸修饰电极测定肾上腺素等7。电化学检测器因灵敏度高，选择性好，应用于毛细管电泳和微柱液相色谱。 25 酶法分析 利用酶试剂作为工具测定物质量的方法。酶法分析具有专属性强、灵敏度高的优点，与其它紫外、荧
13、光、电化学或免疫方法联用可用于酶的活性分析以及与酶作用的底物或产物的分析以及抗体药物的效价测定17,18。 26 免疫分析 免疫分析方法是以特异性抗原抗体的反应为基础的分析方法。免疫分析技术和放射性核素示踪技术、酶促反应或荧光分析等高灵敏度的分析技术相结合，具有高特异性和高灵敏度的特点，特别适合测定复杂体系中的微量组分，以及药物生产中发酵液或细胞培养液中有效成分的快速测定。如酶联免疫吸附法(ELISA)用于基因工程药品中微量致敏性杂质青霉噻唑蛋白的测定2，胰岛素有关蛋白的检查10等。免疫分析技术与色谱的联用，利用色谱技术对药物、激素等分子间微小差别的高识别性，可提高免疫分析的选择性与灵敏度。
14、3生物检定法 利用药物对生物体或离体器官所起的生物活性作用的强弱而进行定量分析的一种方法，可用于药物的杂质检查、有害物的毒性测定和药物的效价测定2。我国药典（1995）对肝素、绒促性素、缩宫素、胰岛素等均采用生物检定法进行效价的测定。生物检定法一般与药物的活性、药效密切相关，结果较为直观，但使用动物量较多，实验操作繁琐，影响因素多，精密度差，现正逐步被理化方法所取代。 二发展趋势 比较中国药典（95 年版）和美国药典（23 版）可以看出，对于生物药物分析滴定方法在中国药典中仍占有一定的比例，而美国则对 HPLC 的应用较为普遍，我国新药典的科研课题将扩大 HPLC 的应用：对氨基酸、肽、蛋白质
15、、多糖等进行分子量分布的定性或定量的研究；进一步开发毛细管电泳在生物药品中的应用：对蛋白质，酶、肽、核苷酸、多糖等进行鉴别、含量测定等项目的研究；加强细胞免疫法的应用：应用细胞免疫法测定效价等。从近年来生物药物分析的研究报道来看，HPLC 已经成为大部分的生物药物的常规分析方法，而CE 因其本身不可比拟的优势，在生物药物分析方面的应用日益增多，是未来生物药物发展的新趋势。 参考文献： 1 吴梧桐，王友同等.21 世纪生物技术.生物制药.药物生物技术，2001，8(1):1-3. 2 马广慈主编.药物分析方法与应用.科学出版社，2000. 3 中国药典.1995 4 郑健，陈焕文等.紫外-可见分光光度法在药物分析中的应用.分析科学学报，2002,18(2):158-163. 5 周先碗，胡晓倩遍.生物化学仪器分析与实验技术.化学工业出版社.2002. 6 李生英，叶平等.荧光分析法在药物分析中的应用.甘肃高师学报，2002,7(2):41-44. 7 倪坤仪，田颂九等.21 世纪药物分析学的发展趋势.中国药学杂志，2000,35(12):796-800. 8 朱良漪主编.仪器分析手册.化学工业出版社，2000. 9 陈执中.基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱法在生化和基因工程药物分析研究中
