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1、过氧化氢酶米氏常数的测定傅璐 121140012一、实验目的1. 了解米氏常数的测定方法2. 学习提取生物组织中的酶二、实验原理1. 米氏反应动力学米氏方程 (Michaelis-Menten Equation):底物浓度S对酶反应速度的影响底的kjil(nirmb-Li，L)25己檢澈翩t肋）-M15ISHCO；9ittst乳生臼的HIN耳苯甲範赴2W3加两如般悦魚稍U乳観说h罰A017冻韧淮说水齣-苏轴常见的一些酹的心,值2. 米氏常数的意义： 反映酶的种类： Km 是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关，与酶浓度、 底物浓度无关。 米氏常数是酶促反应达到最大反应速度 Vmax 一半时的底物
2、浓度。其数值大 小反映了酶与底物之间的亲和力：Km值越大，亲和力越弱，反之Km值越 小，亲和能力越强。 Km可用来判断酶（多功能酶）的最适底物：Km值最小的酶促反应对应底物 就是该酶的最适底物。集中于纵轴。因此在设计底物浓度时，最好将1/S配成等差数列，这样可使点 距较为平均，再配以最小二乘回归法，就可以得到较为准确的结果。此法优点是横轴上点分布均匀，缺点是1/v会放大误差，同时对底物浓度的选择 有要求。 SKm 时直线将在原点附近与轴相交。4. 氧化酶：生物体内重要的三种氧化酶类，其作用均是消除体内自由基 POD：过氧化物酶 SOD :超氧化物歧化酶 CAT：；过氧化氢酶5. 过氧化氢酶的作
3、用：植物体内活性氧代谢加强而使过氧化氢发生积累。过氧化氢可进行一步生成 氢氧自由基。氢氧自由基是化学性质最活泼的活性氧，可以直接或间接地氧化细 胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并且有非常高的速度常数，破坏性极强，可使 细胞膜遭受损害，加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶(catalase, CAT)可以清 除过氧化氢、分解氢氧自由基，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活， 因此 CAT 是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的抗逆性密 切相关。6. 过氧化氢酶活力的测定方法：紫外吸收法：过氧化氢在 240nm 波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240nm
4、）随反应时间而降低。根据测量吸光度的变化速度即可测出 过氧化氢酶的活性。（以一分钟内 A240nm 下降 0.1 为一个单位）滴定法（高锰酸钾法、碘量法）在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准 高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。根据单位时间内消耗的过 氧化氢的量即可测出过氧化氢酶活力大小。7. 实验中的反应 ：H2O2 被过氧化氢酶分解出 H2O 和 O2 , 未分解的 H2O2 用 KMnO4 在酸性 环境中滴定, 根据反应前后的浓度差可以算出反应速度:酶2H2O2 2H2O + O22KMnO4+5H2O2+3H2SO4 - 2MnO4+K2S
5、O4+8H2O+5O2（本实验以马铃薯提供过氧化氢酶）三、实验试剂1. 0.02mol/L 磷酸缓冲溶液 （pH=7.0）: 实验室提供.2. 酶液: 称取马铃薯 5g, 加缓冲液 10mL, 匀浆过滤.3. 0.01mol/L 高锰酸钾.4. 0.098mol/L H2O2.5. 25%H2SO4.四、实验操作取 6 只锥形瓶, 按下表的顺序加入试剂 .、瓶号 试剂12345(K098M H2O2/nil0imL25L672.55JM)蒸懾水巾皿9.58.508*257.837.0丄列）酶液/ml0.50.50.50.50.5(k5滴定用去KMnOyinlViv2v3v4v5样品实际消耗的K
6、MnOmlvrvflv2-v0V3-V0v4-v0vv0先加好过氧化氢和蒸馏水 , 加酶液后立即混合, 依次记录各瓶的起始反应时间 . 反映到达 5min 立即加入 2ml 25%硫酸终止反应, 充分混匀.。用 0.01mol/L 的 KMnO4 溶液滴定瓶中剩余的过氧化氢至微红色, 记录消耗的高锰酸钾体积.。五、注意事项：1.反应时间必须准确。2.酶浓度须均一，若酶活力过大，应适当稀释3. 滴定终点的判定。六、实验结果：过氧化氢浓度：0.098mol/L称取马铃薯的质量： 5.00g高锰酸钾： 0.01mol/L序号1345V (KMnO4) /ml2.74.46.3212.4S/(mol/
7、L)0.00980.0163680.02450.049v/(mmol/min)0.00610.0107320.01740.0361/S102.040861.094840.816320.40821/v163.934493.179357.471327.7778米氏常数Km= -0.1913七、实验结果分析：1. 曲线上少一个点的原因：用移液管移取序号为2的过氧化氢溶液(应为1.25ml)错误的移取了 1.75ml, 故在制图时将其舍去。2. 曲线线性较好(R2 =0.9988 )的原因： 本实验采取了两人分工的方法完成实验,控制反应结束及滴定分别由一人完成, 所以标准都相同,从而在一定程度上提高了实验的准确性。3. Km计算结果呈负值的原因：Km呈负值(即整条直线都向下移动)，亦即所有测定的v值都偏大。由v=(c1*V1-2.5*c2*V2)/5,故推断最可能的原因是V2整体测量偏小，可能的操 作失误是编号为0的空白对照组中高锰酸钾的滴加量偏高，从而使除去该点的整 体的高锰酸钾量都偏小。
