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1、毛冬青基因组DNA提取方法及ISSR-PCR反应体系的优化付铨盛;卫滢;席秀丽;黄海波【摘要】目的:优化毛冬青基因组DNA提取方法,建立稳定性高、重现性好、适合 其遗传差异分析的ISSR-PCR反应体系方法:对比CTAB法、mCTAB法、SDS法、 蛋白酶K法及植物基因组提取试剂盒的提取效果后，选择mCTAB法结合蛋白酶K 法提取毛冬青基因组DNA,并优化了蛋白酶K用量利用正交试验设计，对毛冬青 ISSR-PCR 反应的 5 个因素(Mg2、dNTPs、Primer、DNA、Taq 酶)进行优 化,PCR结果使用SPSS16.0软件进行分析，基于优化后体系对哥伦比亚大学公布的 100条ISSR
2、引物进行筛选，确定退火温度结果:采用蛋白酶K-mCTAB法实现了 4h 内提取高纯度毛冬青基因组DNA,蛋白酶K用量为20 ngmL-时DNA平均提取 量较传统CTAB法提升9.5倍;毛冬青ISSR-PCR最终反应体系为Mg2+2.5 mmolL-1,dNTPs 0.15 mmolL-1,Primer 0.4pmolL-1,DNA 70 ng,Taq 酶 0.5U. 实验从100条引物中筛选出16条引物并确定退火温度,绘制出毛冬青ISSR指纹图 谱结论:蛋白酶K-mCTAB法适合毛冬青基因组DNA的提取，筛选出的反应体系、 引物及退火温度能够满足毛冬青ISSR-PCR实验的要求.【期刊名称】
3、中国现代中药【年(卷),期】 2016(018)004【总页数】5页(P415-419)【关键词】毛冬青；DNA提取;反应体系优化;引物筛选作 者】 付铨盛;卫滢;席秀丽;黄海波【作者单位】广州中医药大学中药学院,广东广州 510006;广州中医药大学中药学 院,广东广州 510006;广州中医药大学中药学院,广东 广州 510006;广州中医药大 学中药学院,广东广州 510006【正文语种】中文基础研究中药毛冬青是冬青科(Aquifoliaceae)冬青属植物毛冬青Ilex pubescens Hook.et Arn.的干燥根。药理研究显示，其具有抗菌1、舒缓气管平滑肌2、抑制血小板 聚集
4、3、扩张冠脉等作用，主要用于治疗冠心病、心绞痛及脉管炎等疾病，疗效 确切，已有多种以毛冬青为主药的方剂收载于卫生部部颁标准中。近年来毛冬青的研究主要集中于植物化学4和药理学方面5；分子生物学方面研究较少，主要集中在基于ITS序列的分子鉴别方向6。为加深对毛冬青种质资源 多样性、系统发育研究，本研究将优化其DNA提取方法及ISSR-PCR反应体系， 并尝试构建毛冬青的ISSR指纹图谱。1.1 材料及处理 实验材料采自广东省梅州市平远县，经广州中医药大学中药鉴定教研室黄海波副教 授鉴定为冬青科(Aquifoliaceae)冬青属植物毛冬青Ilex pubescens Hook.et Arn.。材料
5、选取新鲜幼嫩毛冬青叶片，用70%乙醇水溶液清洁表面后迅速置于放有变色 硅胶的塑封袋中快速干燥备用。1.2 仪器和试剂OSE-Y20电动研磨杵(天根生化科技有限公司)、T100 PCR仪(Bio-Rad)、Powerpac Basic电泳仪(Bio-Rad )、OSE-260核酸蛋白分析仪(天根生化科技有 限公司)、Tanon-2500凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)。dNTPs、Ex TaqDNA 聚合酶、Mg2 +、10x Ex Taq Buffer、Marker、蛋白酶 K、 RNase(Takara公司)，聚乙烯比咯烷酮(PVP)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、0- 巯基乙醇(S
6、igma公司)，植物基因组提取试剂盒(天根生化科技)，其余为国产分析 纯试剂；引物根据哥伦比亚大学提供的ISSR引物序列由北京六合华大基因科技有 限公司合成。2.1 DNA提取及纯化实验对比CTAB法7、mCTAB法8、SDS法9、蛋白酶K法10、植物基因组 提取试剂盒5种提取方法后，选择mCTAB法结合蛋白酶K法作为最终方法进行 提取。2.1.1 缓冲液配制缓冲液 A 由 100 mmolL-1 Tris-HCl (pH 8.0)、5 mmolL-1 EDTA-Na2、0.25 mmolL-1 NaCI 组成，使用前加入 20 mgmL-1 PVP-40T。 缓冲液 B 由 100 mmoI
7、L-1 Tris-HCI(pH 8.0)、25 mmoIL-1 EDTA-Na2、1.4 mmoIL-1 NaCI、40 mgmL-1 CTAB、10 mgmL-1抗环血酸组成，使用前加入 20 mgmL-1 PVP-40T、10 mgmL-1 Na2B4O710H2O、0.4% p-巯基乙醇。 2.1.2提取方法取40 mg去主脉干燥叶片，用电动研磨杵加适量液氮研磨15 s ; 加入1 mL的缓冲液A冰浴10 min，期间颠倒混匀数次；12 000 rmin-1(13 400xg)离心5 min弃上清液；重复加入缓冲液A至上清液黏稠度下降；加入1 mL 缓冲液 B、20 pL(20 mgmL
8、-1)蛋白酶 K ,65 C水浴 30 min，每 10 min 颠 倒混匀1次；待样品冷却至室温，12 000min-1(13 400xg)离心5 min ;取上 清液，加入等体积苯酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1),缓慢颠倒混匀10 min使两 者充分混合均匀,12 000 rmin-1(13 400xg)离心5 min，取上清液；重复加入 苯酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1)至上层液体澄清；取上清液加入等体积三氯甲 烷-异戊醇(24:1),缓慢颠倒混匀10 min ,12 000 rmin-1(13 400xg)离心5 min ;取上清液加入100 pL 3 moIL-1 NaA
9、c及等体积预冷异丙醇，轻轻混匀，- 20 C保存 30 min ；12 000min-1(13 400xg)离心 5 min，弃上清液；加入 0.1 mL 100 mgL-1 RNase ,37 C消化 30 min ;加入 0.1 mL 去离子水、0.1 mL 5 molL-1 NaCI，0.8 mL 预冷 95%乙醇，轻轻混匀，12 000 rmin-1(13 400xg) 离心 5 min，弃上清液；加入0.5 mL 90%乙醇，轻轻弹起沉淀，12 000 rmin- 1(13 400xg)离心2 min，弃上清液，重复本步骤1次；无菌环境敞开EP管口挥 干乙醇，加入0.1 mL TE溶
10、解DNA过夜。样品经1%琼脂糖凝胶电泳，选择无拖 尾、带形清晰的样品用核酸蛋白仪检测浓度，统一稀释至50 ngpL-1,供后续实 验用。2.2单因素考察蛋白酶K用量实验采用单因素考察的方式对蛋白酶K使用量进行考察，设置5、10、15、20 pLmL-14个水平，每个水平设置2个重复。2.3正交设计优化PCR反应体系针对影响PCR反应的Mg2 +、dNTPs、Taq酶、引物和模板等的浓度5个因素， 以预试验优化过的UBC807为实验引物，选用L16(45)正交表，在4个浓度水平 上进行试验，正交设计见表3。正交试验共16组，每组设2个重复，合计32个反应。PCR反应体系为20 pL, 扩增程序为
11、94 C预变性5 min ,94 C变性30 s ,52 C退火30 s ,72 C延伸90 s , 35次循环，72 C延伸10 min ,4 C保存。产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，电 泳条件为80 V 15 min , 100 V 30 min，结果经凝胶成像系统拍照分析。2.4 引物筛选及退火温度优化采用优化后反应体系对哥伦比亚大学公布的100条ISSR引物在其TM值上2 C 进行筛选,选择条带数量多、间距合适、基本清晰的引物进行退火温度优化。使用 T100 PCR仪在50-56 C自动生成8个温度梯度，选择50.0、51.1、52.3、 53.7、54.8、56.0 C进行退火温度筛选。
12、3.1不同提取方法DNA提取结果5种方法提取的DNA在TGem超微量分光光度计上检测结果如表4所示，高纯 度DNA的A260/A280的值为1.7 1.9，若吸光度小于1.7则可能存在蛋白污染， 大于2.0则DNA已降解或存在RNA残留。实验结果显示：采用CTAB法、 mCTAB法、SDS法提取的组DNA的A260/A280均小于1.7，可能存在蛋白污 染；mCTAB法平均提取量较CTAB法提升79% ；蛋白酶K法处理的样品在质量 和提取量上均有提升；植物基因组提取试剂盒采用硅基质膜吸附柱法对样品进行提 取，特异性吸附DNA，故提取物纯度较高，但由于其成本高、柱容量有限，难以 满足后续实验的要
13、求，故选择mCTAB法结合蛋白酶K法进行提取。3.2不同剂量蛋白酶K对提取效果的影响经蛋白酶K处理后，获得的毛冬青组DNA纯度高、完整型好，提取量随蛋白酶K 使用量的增加而增加。在20 pLmL-1水平下能够获得较高的提取量，综合考虑实 验成本及实际需求，不建议继续增加蛋白酶K使用量。见表5、图1。3.3 ISSR-PCR反应体系的正交设计结果分析使用引物UBC807进行反应体系优化的PCR产物电泳结果见图2，参考何正文等 11的方法对扩增结果多态性进行评分：条带数量丰富、稳定、清晰的计15分， 涂布带或无条带计1分，得分越高的反应体系扩增效果越好，反应116的平均 计分依次为：3、11、15
14、、13、4、7、12、14、4、8、9、12、4、1、3、10。 依照参考文献计算，最终反应体系为Mg2+ :2.5 mmolL-1, dNTPs : 0.15 mmolL-1, Primer :0.4 pmolL-1, DNA : 70 ng , Taq 酶：0.5 U。 3.4引物、退火温度筛选 退火温度与引物、反应体系、模板种类等因素存在较大关系，温度过低会引发引物 与模板错配，产生非特异性扩增，使条带模糊甚至拖带，退火温度过高则会抑制引 物与模板的结合，导致扩增条带减少。本实验从初筛后有清晰条带的32条引物中 优选出16条引物，对其退火温度进行进一步筛选，部分筛选结果见图3，最终引 物
15、及退火温度见表6。3.5毛冬青ISSR指纹图谱的建立最终引物的电泳结果使用Quantity One(Bio-red co.)软件进行处理，对带型好、 辨析度高的序列排队及编号后，将电泳结果图转换为1/0原始矩阵，有条带记为“1”，无条带记为“0”，并根据该矩阵绘制毛冬青ISSR指纹图谱，见图4。 完整度高、纯度高的DNA是ISSR-PCR准确可靠、重现性好的基本保障。毛冬青 叶片内含有多糖、蛋白质、酸性及酚性皂苷类成分12，蛋白质及多糖容易与 DNA形成复合物，使DNA溶解度降低，同时抑制Taq酶活性影响PCR扩增13； 酚类与多酚氧化酶结合后极易氧化，在完整的细胞结构中二者被细胞膜分隔，因此
16、 较为稳定，当细胞破壁后，两者结合发生氧化反应影响DNA的质量14。本实验结合mCTAB和蛋白酶K法对毛冬青基因组DNA进行提取，CTAB free的 缓冲液A可去除大部分次生代谢产物，降低提取液黏稠程度，缓冲液B中的抗坏 血酸、PVP、p-巯基乙醇和硼砂4种抑制因子共同作用，有效防止DNA的褐变； 蛋白酶K的加入在减少DNase和RNase的同时有效地消化植物组织中与DNA 结合的以及提取过程中与DNA形成共沉淀的蛋白质，使DNA游离于上清液中； 结合苯酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1)两次抽提，进一步减少了蛋白质和多糖的 污染。本方法实现了 4 h内获得高纯度、高浓度的毛冬青基因组DNA，为后续实 验提供了保障。近年来，利用分子标记技术对物种进行快速鉴定的技术发展迅速，其高分
