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1、免疫组化试剂验证试验记录表仪器、设备：移液器、免疫组化笔、微波炉或高压锅、计时器、孵育湿盒、染色架、 盖玻片、光学显微镜、洗瓶等。溶液配制:PBS溶液配制；EDTA组织抗原修复液及DAB显色液使用详见免疫组化 试剂盒产品说明书操作步骤。实验温度：15-28C实验步骤：1. 脱蜡水化1）石蜡切片置于新鲜的二甲苯中，浸泡15 minx 2次；2）去除多余的液体后，置无水乙醇中，浸泡3 min x 2次;3）去除多余的液体后，置95%乙醇中，浸泡3 min ;4）去除多余的液体后，置85%乙醇中，浸泡3 min ;5）自来水冲洗1 min ;6）PBS溶液冲洗3 minx 3次。2. 加热EDTA抗
2、原修复液（试剂1,采用微波进行抗原修复）1）将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯（或修复盒）中的耐高温塑料切片架上;2）加适量的修复液1x EDTA抗原修复液，（溶液1,用纯净水稀释20倍后）于烧杯中，液面要浸过切片组织一定高度;3）微波炉先用高档加热使液体沸腾，当加热至沸腾时调到中档，此时开始计时，修复时间一般为20 min，此过程中勿使组织干片（修复液要足量）；4）将烧杯从微波炉中拿出，放入冷水中冷却降温；5）当修复液降至室温后取出玻片用PBS（ PH7.4 ）冲洗3 minx 3次。 注意：抗原修复时，修复液务必保证切片始终浸泡在液体内，一般情况：修复 液的量为800 mL/1架-1500 m
3、L/3架；取出玻片，用PBS冲洗时，切勿对着组织冲洗，以免弄破组织。3. 阻断内源性过氧化物酶1）用吸水纸擦干玻片，免疫组画笔在组织周围画圈；2）将3%的过氧化氢（试剂2 ），滴加100 pL到切片组织上以阻断内 源性过氧化物酶，室温孵育15 min ；3）PBS 冲洗 3 min x 3 次。4. 封闭用吸水纸擦干玻片，滴加正常山羊血清（试剂3 ），室温封闭15 min , 以减少非特异性染色。5. 一抗孵育1）用吸水纸擦干玻片组织周围的液体；2）滴加单克隆抗体（试剂4）100 pL,如果做阴性对照实验，就在对 照组的组织上滴加PBS作为阴性对照，置于湿盒中室温孵育1h或4C孵育过 夜。6.
4、复温1）样本4工过夜从冰箱拿出后需在室温下孵育15 min复温（抗体孵育 为4工过夜选用此步骤，如室温孵育直接进入下一步清洗）；2）PBS 冲洗 3 min x 3 次。7. 加聚合物辅助剂（试剂5）1）吸水纸擦干切片后滴加试剂5 （ Polymer Helper）,室温或37工孵 育 20 min ;2）PBS 冲洗 3 min x3 次。8. 二抗孵育1）吸水纸擦干切片后滴加试剂6（Polyperoxidase-anti-mouse/rabbit IgG ），室温或 37C孵育 20 min ;2）PBS 冲洗 3 min x 4 次。9.显色1）甩去PBS液，吸水纸擦干切片；2）每张切片滴加新鲜配制的DAB显色液100 pK试剂7试剂8=1:49 比例配置），孵育3-5 min，光学显微镜下观察染色结果，切勿显色过深；3）显色后用自来水冲洗切片终止显色。
