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1、不同氮、磷浓度对微藻生长代谢的影响1 目的与意义扁藻（Tetraselmis Chui）隶属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、衣藻科的海藻。扁藻作为海产品幼体前期的优质植物性饵料，对海产品幼体的生长发育有着极其重要的作用。对所投喂的动物性饵料，如轮虫、裸腹蛋、丰年虫等起着良好的同步强化作用；通过扁藻的光合作用，能降低并消除育苗水体的有机污染和其他有害物质，并为水体提供充足的氧气，保持养殖生态系统的良性循环，达到改善水质目的。盐藻（Duanziezla salsna）隶属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、盐藻科的海藻，其原生质裸露，体形变化很大，单细胞、无细胞壁、具两条等长鞭毛。盐藻的人工培养始于20世纪60年
2、代，主要用于鱼、虾、贝类幼体的饵料。真正以提取-胡萝卜素为目的的盐藻培养始于20世纪70年代。盐藻在代谢过程中除积累-胡萝卜素外，盐藻在以海水为培养基培养时，可积累大量的蛋白质，含量高达细胞干重的5060%，其中含有包括人类必需氨基酸在内的18种氨基酸，是一种优良的蛋白饲料或人类食品加工原料。盐藻在胁迫的环境中还积累大量的甘油，含量高达干重的80%。天然甘油是优质的化妆品原料，同时也是化工、轻工和医药工业的重要原料。绿色盐藻藻体内还含有的植物蛋白、脂肪酸、多糖、叶绿素、甘油等多种营养成分和生物活性物质，可应用于人体保健、生物制药、基因工程等领域，开发天然保健品或生物药品以及耐盐基因应用研究，具
3、有一定的应用价值，具有广阔的应用前景。微藻生长所需要的营养元素有1520种，天然水体或土壤里的大多数元素都能满足它的需要，不会成为限制性因子。淡水中常缺磷，而海水中常缺氮，氮和磷含量过低常会限制微藻的生长。所以N、P是微藻生长的主要营养盐。因此，本文对微绿球藻和盐藻对N和P营养盐需求的研究，以期为今后为海洋微藻培育过程中营养盐的研究和微藻生态调控防病技术的研究应用提供资料。2.1 藻种：扁藻（Tetraselmis Chui）、盐藻（Dunaliella salina）2.2 实验设计2.2.1不同盐度对微藻生长特性及氮、磷利用的影响实验所用海水取自近海海域，经过棉花粗滤、0.45pm醋酸纤维
4、滤膜过滤，120高温灭菌20min后使用。自然海水中加入NCaI或蒸馏水，设置盐度梯度为10、25、40、55、70，原始海水的盐度为33。实验培养基为：NaHCO33.0g/L、NaNO31.0g/L、KH2PO40.025g/L、f/2微量元素lmL、f/2维生素lmL。用250mL的锥形瓶，取处于对数生长期的藻种接种，置于光照摇床进行一次性培养，培养温度201，摇床转速100rpm，光照强度2500-3500lx(1.0mW/cm2=46mmol/(m2S)=25001x)，持续光照培养。培养过程中每天定时测定藻的光密度OD、细胞生长速率K，培养结束后测定藻体中各种生化成分如叶绿素a、多
5、糖、蛋白质的积累情况，并测定培养液中硝态氮和无机磷的剩余量以考察微藻在不同盐度下对氮磷的利用情况。2.2.2不同氮、磷浓度对微藻生长特性及氮、磷利用的影响（1）氮浓度比较实验NaNO3加入量分别设置为0（无N组）、0.1、0.4、0.8、1.2g/L，其他培养基成分为NaHCO33.0g/L、KH2PO40.025g/L、f/2微量元素lmL、f/2维生素lmL，用250mL的锥形瓶，取处于对数生长期的藻种接种，置于光照摇床进行一次性培养，培养温度201，摇床转速100rpm，光照强度2500-3500lx(1.0mW/cm2=46mmol/(m2S)=25001x)，持续光照培养。培养过程中
6、每天定时测定藻的光密度OD、细胞生长速率K，培养结束后测定藻体中各种生化成分如叶绿素a、多糖、蛋白质的积累情况。（2）磷浓度比较实验KH2PO4加入量分别设置为0(无P组)、0.015、0.03、0.045、0.06g/L，其他培养基成分为NaHCO33.0g/L、NaNO31.0g/L、f/2微量元素lmL、f/2维生素lmL，同上培养。（3）无氮磷营养盐实验培养基成分为NaHCO33.0g/L、f/2微量元素lmL、f/2维生素lmL，同上培养。2.2.3 不同氮磷比对微藻生长特性及氮、磷利用的影响以NaNO3为氮源，加入NaNO3使浓度依次为0.05、0.2、0.5、0.8、1.0g/L
7、，以KH2PO4为磷源，加入KH2PO4使浓度依次为0.06、0.06、0.04、0.007、0.008g/L，设置N:P比分别为l:l、4:l、16:l、80:1、160:1，同上培养。2.2.4 不同氮化合态比例对微藻生长特性及氮、磷利用的影响按总NH4+-N、NO3-N所占比例不同分为5个处理，分别为NH4+-N:NO3N=10:1，3:1，1:1，1:3和1:10，实验培养基为：NaHCO33.0g/L、NaNO31.0g/L、KH2PO40.025g/L、f/2微量元素lmL、f/2维生素lmL。2.3 指标的测定及方法2.3.1 藻体计数用三角烧瓶培养高浓度的扁藻、盐藻藻液（约30
8、00104cells. mL-1），稀释成一定的浓度梯度后用分光光度计(680nm、700nm) 测定光密度值，将藻液用血球计数板计算其细胞数，制作工作曲线。培养过程中每天上午定时用分光光度计（680nm、700nm）测出各锥形瓶中的相应的藻细胞浓度，以不加藻种的相同培养液为空白。2.3.2 细胞生长速率的测定细胞生长速率K=(lnX2-lnX1)/T，X2表示T天后的藻密度；X1表示初始藻密度（个/ml）；T表示培养时间。2.3.3 硝态氮浓度的测定（1）标准曲线的制作吸取500pm/mL硝态氮标准溶液。lmL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL、12mL分别放入50mL容量瓶中，用无
9、离子水定容至刻度，使之成10m/L、20m/L、40m/L、60m/L 、80m/L、100m/L、120m/L硝态氮的系列标准溶液。吸取上述系列标准溶液0.lmL，分别放入刻度试管中，以0.lmL无离子水代替标准溶液作空白。在分别加入0.4mL5%水杨酸-硫酸溶液，摇匀，在室温下放置20min后，在加入8%NaOH溶液9.5mL，摇匀冷却至室温。显色液总体积10mL。以空白作参比，在410nm波长下测定吸光度。以硝态氮浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。(2)硝态氮含量的测定取适量藻液5000rpm离心10min，上清0.lmL分别于3支刻度试管中，然后加入5%水杨酸-硫酸溶液0.4
10、mL，混匀后室温下20min，在慢慢加入9.smLS%NaH0，待冷却至室温后，以空白作参比，在410nul下测定其吸光度。通过标准曲线计算藻液中硝态氮的含量。2.3.4 多糖的测定葡萄糖标准曲线制作：精密称取分析纯葡萄糖0.1g，加少量蒸馏水溶解，移至1000mL容量瓶定容至刻度，得0.lmg/mL葡萄糖溶液。取0.1mg/mL葡萄糖溶液0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90(mL)，用蒸馏水补充到1.00mL，分别加入4.00mL蒽铜试剂，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸10min取出，用
11、自来水冷却，室温放置10min左右，测OD620值。以同样方法处理重蒸蒸馏水为空白对照，进行比色。以光密度值为纵坐标，糖含量的微克数为横坐标，建立标准曲线。取适量体积藻液，5000prm下离心10min，上清藻液待测胞外多糖，藻泥加入等体积PBS缓冲液，冻融破碎3次，充分振荡后，5000prm离心10min，各取1mL于4mL蒽铜中，沸水浴中煮沸10min，自来水冷却至室温，620nm比色，根据葡萄糖含量标准曲线，分别得到胞内外多糖含量。实验中PBS缓冲液为8.5953gNaH2P04与0.9361gNa2HP04于500mL棕色容量瓶，去离子水定容。2.3.5 蛋白质含量的测定取适量体积藻液，5000rpm离心10min，弃上清，藻泥加入等体积PBS缓冲液冻融破碎3次，充分振荡后，5000rpm离心10min，取1mL上清液加入4mL考马司亮蓝溶液，测定在595mn波长处的吸光度。以1mL0.9%NaCl加4mL考马司亮蓝作参比。根据蛋白质标准曲线，确定样品藻体胞内蛋白质的含量。
