面包酵母流加培养与分批培养试验

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1、面包酵母流加培养与分批培养试验l 实验目的及要求要求学生掌握通风发酵的基本原理及过程，掌握上罐操作技术。掌握流加补 料控制技术。(1) 发酵罐及管路、空气过滤器灭菌操作及发酵罐系统管路的熟悉(2) 实罐灭菌-培养基灭菌实验(3) 观察并记录酵母菌扩培过程及上罐发酵过程菌种生长变化情况(4) 测定酵母培养过程中还原糖、总糖、pH和酵母浓度的变化，并画出各自 的变化曲线(5) 分析测定面包酵母的发酵活力。2 实验原理面包酵母(分子式：C3,2H6.11O1.45N0.6l+P0.035+K0.05l+5-6g其它物质)培养是最 典型的细胞物质生产过程。利用葡萄糖为碳源，通风培养面包酵母的微生物反应

2、 过程可用下列化学平衡式表示：6.67CH2O+2.10O2-C3.92H6.5O1.94+2.75CO2+3.42H2O(碳水化合物)(酵母菌体)20067.284.612161.6如果在酵母菌体内再计入除碳，氢，氧以外的其它无素如氮，磷以及灰分， 则每200g碳水化合物约可得到100g干酵母。即得率约为50%。在通风供氧充足的前提下，培养基中葡萄糖的浓度是限制性基质。培养基中 葡萄糖的浓度对于提高酵母得率是至关重要的。培养方式分为分批培养、分批补料(流加)培养和连续培养。本实验面包酵母 培养的目的是获得最大酵母浓度。因此采用流加培养较为理想。其原理是所谓的 反巴斯德效应(CABTREE):

3、酵母培养过程中，糖浓度过高时.即使溶解氧很充 足，但由于糖生成乙醇，从而使菌体得率下降的现象。分批培养(Batch culture)：分批培养是微生物在特定条件下只完成一个生长周期(growth cycle)的方法， 即接种少量微生物在一密闭系统中生长繁殖，直到某些营养物耗尽或某些产物积 聚到毒害浓度为止。生长中微生物群体所经历的几个生长阶段分别为迟滞期(1ag phase)。对数生长期(exponential phase)，稳定期(stationary phase)，死亡期(death phase)营养物质(底物)的浓度与组成影响微生物培养的生长速度，对微生物的生长 起到限制作用的营养物即所

4、谓的限制性底物。1949年莫诺(Monod)发现微生物比 生长速率与单一限制性底物存在一定联系并借助数学方法建立了著名的经验公 式莫诺(Monod)方程：SU = U m K + SS卩：比生长速率，单位菌体在单位时间的增殖量(h-1)卩m最大比生长速率(h-1)k m：微生物对底物的半饱和常数(g/L)S：单一限制性底物浓度(g/L)在从对数生长期与稳定期变化的过程，可称为减速期，此时细胞比生长速率 和限制性期浓度符合 Monod 方程。分批补料培养(Fed-batch culture)分批补料培养是Yoshida等(1973)创用的，是指分批培养过程中连续地补加 培养基，而不从发酵器中间断

5、地放出培养液。这样培养液的体积随着时间延长而 增加。分批补料培养是分批培养和连续培养之间的一种过渡培养方式，兼有两者 的优点又可克服它们的缺点，因此在发酵工业中被广泛运用。分批补料培养中当达到最大菌体浓度时开始补加培养基，且流加培养基速率 与底物被消耗速率相等，虽然菌体总数在不断增加，而细胞浓度仍为一个常数， 这种状态被称为半稳态或准稳态(Quasistady state)。A.当以恒速流加培养基达到准稳态时：稀释率D =F(V + Ft)0D 随时间而下降。d (XV)dtdV FF比生长速率(h-1)卩=D = 一Vdt V (V + Ft)0补料液浓度(mol/L) S =FYX/S补料

6、速度(L/h) F = V r00式中X：菌体浓度(g/L)Yx/s:基质对菌体转化率(g/mo1), 一般以葡萄糖为基质酵母培养时Yx/s 约为 90gmol。B.上述的恒速流加在一些次级代谢产物的生产中可以用到，但在以菌体为目的 的培养就不适用了。当培养目的为获得菌体时，并要使限制性底物的浓度保持一 定浓度，且菌体的比生长速率保持恒定，必须采用变速流加的方法，加料速度随 时间指数增长。理想的变速流加时体积与补料速度变化为：醪液体积V = V e Mt0补料速度F = M V e Mt0所谓Crabtree效应即Crabtree(1929)发现，面包酵母的呼吸活力对游离的葡 萄糖十分敏感，当

7、其浓度在5“ g/L时即出现阻遏作用。为获得最大酵母得率， 不能用恒速流加的方法，而保持最大生长速率的变速流加法只是理想状态。现今 酵母的分批补料发酵的生产所采用的方法是以自动测定发酵器的排气中的微量 乙醇含量来严格控制糖补入量，这样，得到的菌体量接近理论得率。3 菌种和培养基3.1 菌种：面包酵母3.2 培养基3.2.1 酵母斜面培养基10麦芽汁固体斜面，pH5.03.2.2 酵母摇瓶种子培养基10麦芽汁，pH5.0或葡萄糖10%，玉米浆1%,尿素0.2%, pH5.0。3.2.3 酵母分批发酵培养基（糖蜜培养基） 玉米粉经液化、糖化，折合葡萄糖浓度为10%，玉米浆1%，硫酸铵0.4% pH

8、5.5。3.2.4酵母分批补料发酵培养基（学生讨论提出）4 实验仪器、设备（1）10升全自动发酵罐；（2）摇瓶机（或摇床）；（3）超净工作台；（4）离心机（5）显微镜（6）分光光度计（7）三角瓶。5 实验过程5.1 分批培养5.1.1 总流程斜面培养|斜面培养基配制与灭菌，接种，培养!所需仪器物品：灭菌锅，试管，棉塞，培养基原料，培养箱摇瓶种子| 300毫升种子液，500ml三角瓶三只。装液100ml，培养基，培养摇 瓶，纱布。!上罐培养| （糖蜜）糖化液稀释至10%浓度，添加辅料，灭菌，接种。!菌体分离|离心机或板框过滤器5.1.2 斜面种子制备自保藏斜面中挑取一环酵母菌体接入新鲜的斜面试管

9、中，于28C培养箱中 培养 24h。5.1.3 摇瓶种子的制备将上述培养好的斜面种子接入500ml三角瓶装的灭过菌的100ml摇瓶种子 培养基中，在28C，200rpm震荡培养15-20h。5.1.4 发酵罐培养10升发酵罐装入7升发酵培养基，121C灭菌20min,冷却至30C，将培养 好的摇瓶种子接入发酵罐（接种量23%）进行发酵。发酵条件为：温度28C, 搅拌转速400rpm,通风量1vvm。5.1.5 过程监控0 小时：取样测定总糖和还原糖； 424小时：每隔4小时取样镜检、测定还原糖、菌体浓度； 5.2 分批补料培养（学生讨论提出）要求分析决定初始体积V0,比生长速率”及菌体浓度X的

10、测量，补料速度 F与补料浓度SF的计算与控制。6 实验时间 三天7 实验分析项目和方法（ 1 ）酵母镜检；（2）酵母浓度测定（湿重法）：吸取5ml菌液，2500rpm离心5min,去上清液， 称量菌体湿重（ 3）还原糖浓度： （见附一）（4）酒精度的测定：（气相色谱法或比重法）（5）发酵活力的测定（选做）：称取0.26g鲜酵母，加5g在30C下恒稳1h的面粉 制成面团。置于30C水中.测定面团从水底浮出的时间。浮起时间在15min内 认为样品合格。8 实验报告内容和数据处理实验设计原理，两种不同发酵方式酵母浓度的变化规律，作出相关参数指标 随时间变化的曲线图。9 实验结果和讨论（1）流加培养与

11、分批培养菌体浓度的区别何在及原理分析。（2）推导理想状况下准稳态恒速流加与变速流加时变量与时间参数的方程。10 参考书（1）伦世仪主编，生化工程，中国轻工业出版社（2）俞俊棠、唐孝宣，生物工艺学，华东化工学院出版社（3）P. Stanbury,A. Whitaker，发酵工艺学原理，中国医药科技出版社附一 还原糖的测定1 原理 原糖的测定采用快速法。其反应与粗淀粉测定相似，不同点为斐林试剂甲液 中硫酸铜量较小，适用于含糖量较少的试样。另外，斐林试剂中加入亚铁氰化钾 （黄血盐），使红色氧化亚铜沉淀生成可溶性的复盐，反应终点更为明显。Cu2O+K4Fe（CN）6+H2O=K2Cu2Fe（CN）6+

12、2KOH（淡黄色）2 试剂2.1 斐林试剂甲液：称取35g硫酸铜，0.05g次甲基蓝，用水溶解并定容至1000ml。 乙液：称取 117g 酒石酸钾钠， 126.4g 氢氧化钠， 9.4g 亚铁氰化钾，用水溶 解并定容至 1000ml。2.2 0.1%标准葡萄糖溶液精密称取1.0000g经95105C烘干的无水葡萄糖，用少量水溶解，加入5ml 盐酸，用蒸馏水定容至1000ml,摇匀。3 仪器与设备（1）三角瓶（2）容量瓶（3）分析天平（4）干燥器（5）电热恒温干燥箱（6）滴定管（7）称量瓶（8）移液管（9）电炉4 测定步骤4.1 斐林试剂的标定吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶

13、中，加10毫升水， 并从滴定管中预先加入约20毫升0.1%标准葡萄糖溶液（其量控制在后滴定时消 耗0.1%标准葡萄搪溶液1毫升以内），摇匀，于电炉上加热至沸，立即以45秒 钟1 滴的速度继续用 0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在 1 分钟内完成，总耗糖量为 V0 毫升。4.2 定糖 预备试验：吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加入V毫升试样稀释液（含葡萄糖量约为515毫克）及适量的0.1%标准葡萄糖溶液， 摇匀，以下同标定时操作，总耗糖量为 V2 毫升。正式试验：吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加V1毫升试样稀释液和（V2-1）毫升0

14、.1%标准葡萄糖溶液，补加（V0+10）-（V+V2）毫 升水，摇匀，以下同标定时操作，总耗糖量为V毫升。重复测定两次，取总消耗标准葡萄糖液体积的平均值V ml。5 计算 还原糖（以葡萄糖计%） = （V -V）xCxnx丄x 100%0V1式中V。：斐林试剂标定值（毫升）V：斐林试剂测定值（毫升）C：标准葡萄糖溶液浓度(克/毫升)n试样稀释倍数v1：所取试样稀释液体积(毫升)6 说明(1) 滴定速度、三角瓶壁厚度和热源的稳定程度等，对测定精密度影响很大。平 行测定的滴定毫升数相差不应超过0.1ml，故在标定、预备、正式测定过程中， 实验条件应力求一致。(2) 滴定过程应该始终保持在微沸状态下

15、进行。沸腾后继续滴定至终点的毫升数 应控制在 0.5lml 内，否则应重新测定。(3) 样品液中还原糖浓度不宜过高或过低，根据预备试验结果，应将样品液稀释 至还原糖的含量在1%左右为宜。(4) 滴定至终点蓝色褪去之后，就不应再滴定，因四甲基蓝指示剂被还原褪色后 当接触空气时，又会被氧化重现篮色。(5) 斐林溶液与还原糖之间的反应因受溶液碱性、加热湿度和时间以及副反应等 影响，而没有严格的定量关系，不能由当量定律来求出试样中还原糖的含量，只 熊根据在相同实验条件下消耗相应的标准还原糖量或由严格相同的实验条件下 得出的还原糖检索表上查得相应的还原糖量来进行计算。所以用廉-爱农法定糖 时，必须先用相应的标准还原糖标定斐林溶液。7 参考书(1)天津轻工业学院等，工业发酵分析，轻工业出版社， 1980年