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1、5-羟色胺对蚂蚁采食行为的抑制11.介绍 喂养是一个非常复杂的行为，他的调控需要多种不同因素的共同整合。不仅如季节、时间、食品质量等外部条件决定一个动物的采食行为而且生理状态也是。在脊椎与无脊椎动物的许多行为和生理过程中，生物胺发挥着重要的调节控制作用。特别是单胺5-HT（所有具有神经节的动物都具有)在不同类线虫和人类以相同形式编排多样行为和过程控制能量平衡。而在脊椎动物中，一元胺可以作为神经递质，神经调质或神经激素，在中央或外周水平发挥到他的作用。在对不同昆虫进行的药理学实验证明，淋巴或5-HT神经的改变会改变动物的摄食行为。在果蝇中，管理5-HT促进蔗糖消费的减少，他已经证明，这种影响可能
2、是由于减少蔗糖的灵敏度。提高昆虫的蔗糖响应阈，因此也就减少了其食物的摄入量。5-HT对昆虫摄食的力度和效果底层机制还未被确定，5-HT仅仅影响食物消费总量吗?或者说在中央或外围水平5-HT可以在喂养设备的活动物中行动。在一些昆虫种类进行的免疫化学研究发现，血清素系统在主中心的控制喂养和唾液腺口器和消化道。这有力的表明，5-HT在摄食控制盒一体化进程中的调制中起重要作用。然而，苯胺的分布和功能在不同物种间分布不同。昆虫通过吮吸泵实现液体的摄入，其解剖被形容为2个蚂蚁物种：Lasius尼日尔，和Pachycondila簇毛麦。它由两套不同的肌肉扩张，回缩咽颊管组成。肌肉的回缩育扩张，扩大咽产生负压
3、驱动器流体进入口腔。吸血泵活性是nectivorous蚂蚁和camponotus 蚂蚁所具有的特性。这种蚂蚁能够改变蔗糖溶液摄入的速度主要取决于种群糖的饥饿水平。碳水化合物缺乏的蚂蚁通过增加泵的频率来达到更高的摄入率。而且对于一个给定的浓度同时保持几乎恒定的每泵收缩所采取的体积。虽然一直研究蚂蚁摄食行为和摄食控制的许多方面，但没有关于在昆虫中5-HT与摄食相关的有用信息。考虑摄食调制作用的生理状态，目前的工作目的是：（1） 为了分析胺对摄食行为和吸泵活性的影响，所观察到的效果是否是由于蔗糖感知的变化（2） 通过免疫组化学技术研究5-HT与消化道吸泵，肌肉及在喂食中所设计的主要神经中枢的关联。2
4、.材料与方法2.1 昆虫 由1000只蚂蚁组成的六个蚁群。实验中用到一个活更多的王后。这些蚂蚁在阿根廷布宜若斯艾利斯和圣地亚哥德尔艾斯特罗省不活并运送到实验室。每组蚂蚁呗饲养在有塑料盒做成的人工巢或容器中。（30*50*30cm）其基部涂有石膏，墙壁涂有聚四氟乙稀纤维来防止动物逃跑。蚂蚁种群被放置在桩压克力板，她们在容器中可以得到新鲜水，蜂蜜水喝切碎的昆虫碎片。好在自然光/黑暗的循环周期中保持一年并且接近恒温（23+3）之前的行为实验中，六个种群被进行了为期5-15天的碳水化合物饥饿实验。免疫组化学实验在维尔兹堡大学进行。在布宜若斯艾利斯大学校园拍摄的2个C.mus蚂蚁被转运到这个实验室，并保
5、持几个星期。知道试验在25摄氏度。50%RH，12:12h。光/暗周期，自由获得蜂蜜水。2.2 摄食行为实验 2.2.1 采食行为实验 有关于蔗糖溶液喂养期间蚂蚁的吸泵活性的记录。在以前的作品中以描述的形式出现。简单的说，这个实验装着有一个木质平台（是一个覆盖湿滤纸和金属网的表面）制成并进行记录。一个移液管（0.5ml）被放置在正中心，并插入中空，使管的末端接触金属网。管中充满了30%w/w的蔗糖溶液，一点点下降，直到顶端暴露，脱离由一层条体凝胶覆盖的网格。同时，一个点击被固定在金属网，而另一个与溶液接触。当蚂蚁站在网格上并用其口器接触溶液时，电路闭合，允许蚂蚁采食所产生的信号的记录（带通滤波
6、器，amplified 210 ; band-pass filter 0.417 Hz, 3 dB; sampling rate:200 Hz）这个记录被观察并记录存储在装有模拟-数字转换器的个人电脑中。（ADC-212，微微科技有限公司，英国） 实验在不同的日子里的一天内相同时间点对不同种群的蚂蚁进行，每次试验前，一组的十只蚂蚁被允许在实验装置喂养以建立对蔗糖溶液信息素的追踪。事后，实验用的蚂蚁被单独放在平衡的木桥上（9cm*0.2cm）已记录蚂蚁的质量（初始质量）。这座桥在接触通向有蔗糖溶液记录器的平台。一旦放上去，蚂蚁为了发现并得到溶液，并没有感到不安，当蚂蚁将口器深入到溶液，记录开始。
7、实验所提供的溶液的总的量总是比单个蚂蚁一次性所摄入的量大。当蚂蚁喝饱后返回到木桥，它的质量重新被记录（最终质量）。记录完成后，将这些蚂蚁同它们的同伴分离开指导实验结束。 2.2.2摄食行为的变量和参数 摄入溶液的体积计算方法为（摄入溶液的质量/摄入溶液的密度），喂养的时间（s）代表电信号的持续时间，恰好与蚂蚁和蔗糖溶液接触时间相一致。那么（摄入率=摄入体积/摄入的时间）采食的主频率被定义为在所分析所有完整的信号得到的周期图中出现的最高峰。主要频率*摄入时间=泵在整个吸泵过程中的总收缩量。最后，每泵收缩量=总收缩量/摄入溶液的总量 2.2.3服药/管理药品 考虑到蚂蚁的摄食行为有激素状态调控，为
8、了做到非侵入并减少程序的操作动物。我们采用口服药物，将5-羟色胺溶液在30%或20%w/w的包含10mm抗坏血酸的蔗糖溶液中，这主要是为了减少5-羟色胺的氧化，溶液配置好后，储存在10摄氏度环境中（不超过10天），在使用前，解冻5min。根据这个实验，蚂蚁以单体或群体形式喂养控制溶液（蔗糖和抗坏血酸）或添加不同数量的5-羟色胺的蔗糖溶液（详见2.2.4）2.2.4.1：时间依赖型的影响 首先我们要确定所需C.mus-蚂蚁口服接种5-羟色胺所产生效应的时间、同一个群众中的蚂蚁被分隔直径3厘米的水瓶中。用0.25ul，30%w/w葡萄糖溶液喂养为对照组。用0.25ul的5-羟色胺浓度为0.075M
9、为C.mus-蚂蚁的实验组。只有蚂蚁所提供的标量用于实验。此后(每只蚂蚁放置在大木桥上)经行记录（从40分，6.30起记录，冬季，早9.0010.00）卡尔的活动被记录在sucking-pump摄入的30%，w/w蔗糖溶液。为了增加记录数量确保一个良好的time-resolution，我们没有对对蚂蚁侧重之前或在这种分析方法喂食物。 想对于第一个实验的结果，我们在另一个地方进行第二个实验。考虑到先前研究对社会昆虫做了生物胺的口服接种，（Schulz和Robinson，在2001年.Barronel,2002年 Barron和Robinson，2005年）我们决定用以上研究步骤经行实验。把实验蚂
10、蚁分为两组（N=40）其中一组喂养美联储10ul（相当于每只蚂蚁喂养0.25ul，30%的w/w葡萄糖溶液）。另一组喂10ul，5-羟色胺溶液0.075M（开始于，夏季 早上11：00）以上操作进行治疗的每一组，troph-allaxis要被确认为发生在这一组没。喂养行为和脑电活动有suking-pump记录下来。记录时间从3:30-5:30。每个个体在喂养时要进行测量。2.2.4.2 ：剂量依赖效应的影响. 蚂蚁分别放置于水瓶中经口服治疗给0.25ul的30%w/w葡萄糖溶液的方案或一个5-羟色胺溶液0.00075.0.0075，0.075M。记录经行治疗时间大约4小时后（开始于 夏季 早1
11、0:00-12:00）蚂蚁的才是前后要侧重。2.3控制蚂蚁运动活动 控制活动是为了测量喂5-羟色胺是否影响蚂蚁活动和产生设么样的影响。蚂蚁被逐个处理（夏季 早 9:00-10:00）0.25ul，30%w/w的葡萄糖溶液或5-羟色胺溶液0.075M。1或4小时候进行估计。之后这些蚂蚁被逐个放入一个圆形竞技场直径7厘米和一个网状格子边长1.5厘米，并记录第一分钟的现象。于东估计是第一分钟内通过网格线的蚂蚁的数目。2.4 控制2 蔗糖接受阈值（SAR） 蔗糖口味测试，是为了分析在记录中喂养5-羟色胺行为变化是由糖感知变化引起的。蚂蚁群被安置在一个单独烧瓶中。经口服接种0.25ul，20%w/w葡萄
12、糖溶液或5-羟色胺0.075M。约2小时治疗后，蚂蚁逐个放进艾本德试管中，麻醉并在冰上放置40-50分钟。蔗糖口味测试评价了1小时后，最后一只蚂蚁的重量。因此SAT的测试4小时后进行。2.4.1 蔗糖接受阈值SAT的测量 蔗糖接受评估的发生通过了量化，利用蚂蚁的舔的行为（Falibennehe和Josens，2011）。唇的接触利用一根熏牙签用（0.3%，1%，3%。10%，30%或50%.）w/w蔗糖溶液，用升序排列浓度，在第一个刺激实验和后每一个试验之后用应对水。刺激时间间隔为4到5分钟，这些蚂蚁接触刺激导致接触须的延长上颌复杂的唇解决方法被应用。蚂蚁的舔的行为联系被认为是积极的，而蚂蚁既
13、没有揭露复杂的行为也无舔的行为被认为是负面的。对蚂蚁进行测试直到蔗糖浓度首次正面回应。即蚂蚁舔的行为反应蔗糖浓度的指标，用0.3%。1%，2%，3%，10%，30%，50%，60%浓度。蔗糖进行刺激，没有反应的蚂蚁要被淘汰。2.5 免疫组化2.5.1 消化道 主要对象（头宽2毫米）吃饱的蚂蚁群被麻醉并砍下头，头和身体用石蜡固定于牙签上，包括消化道，肠等。用冷冻方法解决（4%甲醛在磷酸盐，PBS，PH=7.2，4，组织被冲洗）1 ：0.1PBS 30分钟。2：:02PBS。TritonX-100（PBST，20分钟）洗完后，在室温孕育在杨消化道2%PBST血清（NGS，ICN，Biomedica
14、ls，NO.191356.Orsay.Franc）一小时，然后准备孕育在PBST图抗血清的主要抗体（1:2000，Diasorin，斯蒂尔沃特，锰，猫20080号，地下编号051007）2%农商一室温下2小时，在2下4天，孵化后组织在PBS洗10分钟和福陆公司在Alexa培养羊抗兔二抗（1:250，分子探针，在PBS-11008）1%农商一，在4洗一次10分钟。2.5.2 SEG和FG 去2只蚂蚁麻醉并斩首，投用石蜡固定在呀签上固定，并进行解剖，侵泡与Ringer溶液，并固定4过夜。头部组织首先在PBS30分钟。事后把他们放入2%的NGS和PBST在孕育室内1小时。整个安装准备在PBST孕育室
15、温，以免疫血清为主，抗体（1:4000）在室温2小时用2%NGS，PBST（1:4000）孕育，组织用PBS10分钟和培养568-标记Alexa.Fluor抗兔二抗（1:25，分子探针。-21124）在PBS，1%NGS，4过夜，筹备工作。培养在Sytox绿（2.5毫米，分子探针，-7020）PBS3小时从3.30室温和染色随后用PBS洗10分钟2.5.3 安装，图像查看和处理 消化道和大脑用乙醇（30%，50%，70%，90%，95%，100%，脱水 10分钟）在甲酯（M-2047，Steinheim,SiymaAldirch公司，德国）安装在特殊的铝滑动由玻璃盖盖玻片中央洞中双方。准备用特
16、殊显微镜用共焦刺激光扫描。（Leica，Tcs，sp 由德国，来场公司，为此拉尔）不同的物镜（100，10，0.4和20.07 NA，imm和40，125）消化道的扫描用488mm激发波长和2um的光学部分吸泵结构，可见化使用表用表皮自荧光SEG扫描和FG激发长波进行。Sytox绿色Alexa Flour 562nm一系列光不扫描距离约1um图像与斐紧ImgeJ的软件（ImageJ的处理，1.44C国立卫生研究院，美国，韦恩Rasband)图像重建和Amira软件。（Mercury计算机系统，TEMS德国柏林）体积测量。2.6 统计分析 在时间依赖性效应实验和运动活性的控制，采用双百方差分析，在获得变量由单向ANOVA或其他Kruska-wallis检查。在剂量依赖实验用案件方差分析表明一个重要结
