新型催化剂

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1、班级：09级化学工程与工艺3班 学号：P092013710 姓名：郭真新型生物催化剂一一核酶和脱氧核酶摘要：对新型生物催化剂核酶和脱氧核酶的研究及发展进行简要的概 述。关键字：生物催化剂核酶脱氧核酶RNA DNANew biological catalysthenribozymedanXyribozymeAbstract:Study on a new biological catalyst enzyme and DNA enzyme and a brief overview of the development.Key words :biological catalyst ribozyme d

2、eoxyribozyme生物催化即酶催化的反应通常被认为是在稀释的、经过缓冲处理过的体液介 质，在普通室温和大气压力条件下进行的。现在看来，这个概念似乎已经过时。 酶反应实际上能够在不同于上述温和条件的逆性环境（有机溶剂、高低温、压力、 氧化剂、卤化物、高盐浓度、偏酸偏碱的pH、表面活性剂等）中实现。近年来， 科学家们还运用化学及遗传修饰技术来构建合成酶，使生物催化剂酶具有愈来愈 高的扰逆特性，以适应工业、农业、医学和环境等领域的需要。一、核酶（ribozym e）1982年美国科罗拉多大学的T.R.Cech等人发现四膜虫rRNA前体在鸟苷存 在，但完全无蛋白质的情况下能进行自我拼接，后来于1

3、986年又发现L19RNA 在一定条件下能够以高度专一性的方式去催化寡聚核糖核苷酸底物切割与拼接。 1983年S.Altm an和N.Pace发现核糖核酸酶P（RN aseP,由20%蛋白质和80% RNA 组成）可催化大肠杆菌tRNA前体在5端切去1个寡核苷酸片段转变为成熟的 tRNA，而其中有酶的催化活性的是RN ase P的RNA 组分。由于T. R.Cech和S. A ltm an各自发现了 RNA的催化活性，因而共同获得1989年的诺贝尔化学奖， 他们定义这类具有催化活性的核糖核酸为ribozym e,通常译为核酶。此后又陆 续发现了其它的RNA催化剂（如：大肠杆菌23S rRNA的

4、特定区域对肽键形成有催 化作用，具肽酰转移酶活性），并人工制造出许多RNA催化剂。它们的作用底物 除了 RNA外，还有DNA、多糖及氨基酸酯等。近年来，人们已利用核酶定点切割RNA分子的特性，开始设计核酶进行抗病毒、抗肿瘤和针对某些遗传疾病的核酶 治疗研究，展示了核酶应用的广阔前景。(一) 酶性RNA从1833年Payen和Persoz发现第一个酶起，直到20世纪80年代初期，发 现的酶已逾4000种，这些酶都是生物体自然产生的具有催化能力的蛋白质。因 此，长期以来人们认为只有某些蛋白质才具有生物催化功能。然而，人类对任何 事物的认识都会经历一个逐步发展的过程。20世纪6070年代，一些著名的

5、哲 人生物学家就曾推测生命发展的早期，核酸也可能具有类似酶的活性，如 Woese8 9 Crick ,Orgel9 10,M il ler,Klug 。80 年代初，Cech 和 Alt man 等人的 杰出工作证实了上述猜测：1981年Cech等发现原生动物四膜虫26SrRNA前体具 有自我剪切功能，并于1986年证明其内含子L219WS具有多种催化功能；1983 年Alt2man等发现大肠杆菌RNaseP的核酸组分M1RNA具有该酶活性，而该酶 的蛋白质部分C5蛋白并无酶活性9】。他们二人因此共同荣获了 1989年的诺贝 尔奖。具有酶活性的RNA被称为ribozyme.随着自然界更多功能的

6、ribozyme的 揭示发现ribozyme 一般具有保守的锤头结构(hammer2head structure)U。一 些实验室利用这一特性设计并合成出一系列新的ri2bozyme 1214，而结合运用 体外选择(in vitro selection)技术15,16】获得了更多不同功能的高效ribozyme , “RNA世界” (RNA world)的概念也随即被提出17。现在可以把所有的ribozyme 分成3类：自我剪接ribozyme、自我剪切ribozyme以及催化分子间反应的 ribozyme.Ribozyme的底物也由RNA扩大到DNA、糖类、氨基酸酯。这些事实表 明了 ribo

7、zyme的普遍性。Ribozyme的催化活性依赖于RNA的结构，具有很高的 底物专一性，这与酶的催化行为极其相似。迄今所发现的天然ribozyme可催化3 种反应，而人工合成的ribozyme可催化12种反应18。(二) 酶性DNA沿着Cech、Altman开拓的思路，生物化学家们设计了含有DNA的ribozyme, 即以不同数目的脱氧核糖核苷酸取代ribozyme保守序列中的核糖核苷酸。尽管 这种取代会导致酶活性的降低19,但也另有实验表明ribozyme中核糖磷酸骨架 并非严格必要20,这为DNA也具有酶活性的研究提供了思考的线索，所以这方面 的工作具有启发意义Dervan21设计了一些D

8、NA结合分子(DNA binding Molecule,即在DNA 端接上一个小分子)，可以作为RNase并断裂DNA;在DNA片段5 端连 上EDTA. Fe，可选择性断裂DNA双链，起到限制酶的作用。Komiyana22】也设计 了一个5，端连接乙二胺(ethylenediamine)的DNA片段作为RNase水解tR2NA phe.Li和Nicolaon23报道一段人工合成的双链回文结构DNA(palindromicduplex DNA)在没有蛋白质的情况下，能够促成另外两个单链片段连接起来,新链 与双链中的一条是同向平行互补的，从而形成三螺旋DNA(triplex DNA)。另外， 离

9、子诱导DNA水解也提示DNA可能具有自催化水解的作用24。1994年 deoxyribozyme的概念终于出现了。美国加州大学Lajolla分校的Joyce G F和 Breaker R R利用体外选择技术得到了一个35 bp的单链多聚脱氧核糖核苷酸， 在Pb2+存在的条件下，该DNA能水解特定位置上插入腺苷酸(rA)的DNA,即rA2G 之间的磷酸二酯键25 ,Joyce据此提出了 “DNA世界” (DNA world)的概念。在 这一年里Usman等人26】化学合成了一个由14个脱氧核糖糖核苷酸组成的单链 DNA片段，它具有类似ribozyme的锤头结构，能够较弱地水解RNA磷酸二酯键。

10、同年,Cuenound27】从许多随机序列池中筛选到一些具有2个保守序列的DNA，这 种DNA能催化两个DNA片段的连接，其中一个片段的3磷酸上接有活化该片断 的咪唑基。而且他们根据这种DNA的序列设计出由47个脱氧核糖核苷酸组成的 单链DNAE 47，在Zn2+存在的条件下它可以连接两个单链DNA底物，其连接速率 比由单链互补模板催化的连接反应的起始速率高3400倍，比无模板背景连接至 少高105倍。也是在这一年里，王身立等2&29独立地发现绿豆基因组DNA具有 催化乙酸萘酯水解的酯酶活性，随后他们又发现小牛胸腺和蜘蛛30】鱼精31、鸡32 和人胚33基因组DNA均具有酯酶活性,并对其检测方

11、法进行了探讨34。另外，戴 君惕等35,36】发现小麦DNA也有酯酶活性。1997年，石东乔发现DNA具有促进二 甲基对苯二胺(PADD)与0 2萘酚(a 2NP)显色的作用。随后余华证明DNA在这一 过程中表现出一种氧化2还原酶类性质，并对DNA的氧化性、还原性以及氧化2 还原酶类性质进行了探讨。(三) 研究的性RNA和DNA的意义自80年代初发现RNA具有酶活性以来，又陆续发现了其他RNA催化剂，并人 工制造出许多RNA催化剂。酶性RNA和DNA的发现具有重要的理论和实际意义。 起初，人们称酶性RNA为ribozyme(核酶)，随着酶性DNA的发现，ribozyme 的概念也不仅指酶性RN

12、A,同时也应包括酶性DNA.核酶的发现使人们从此不再认 为生物化学反应都是由蛋白质催化的，许多复杂的由RNA和蛋白质构成的顺粒具 有特别重要的生物学功能，如核糖体，剪接体，加工体和信号识别蛋白质。RNA 具有的催化功能使人们必须重视RNA分子在这些颗粒中的地位和作用；酶性RNA 的底物是RNA，其作用位点有着高度的特异性，可以用来切割特定的转录产物。 有人将这种切割作用叫做抗基因活性，因为切割的结果破坏RNA,也就抑制了基 因的表达。目前正在研究酶性RNA在抗爱滋病和抗储等医疗方面的应用。由于酶 性DNA比RNA更稳定，(DNA分子戊搪的2位碳原子上是氢，RNA的则是羟基， 而羟基很容易氧化。

13、)因此，在医疗上酶性DNA可能将较酶性RNA具有更广泛的 前途。此外，酶性DNA的发现对研究生命起像也有重要意义。80年代初，发现酶 性RNA后，人们又认为RNA是最先起深的生命物质，90年代中期，发现了 DNA 也具有酶活性，由于DNA的复制能力与稳定性均远远大于RNA,因而目前生物学 界亦有人认为DNA是最早起稼的生命物质。根据分子生物学的“中心法则” DNA 要先转录出RNA，再转译出蛋白质之后，才能表达酶的活性来。现在发现DNA本 身就具有某些酶的活性，这对“中心法则”也是一个重要的补充和发展。二、脱氧核酶(deoxyribozym e 或 DNA zym e)这是20世纪90年代中后

14、期发现的一类具有酶活性的DNA分子，它的发现 是人类对于酶的认识的又一次重大飞跃。Carm i等通过体外选择技术合成了 1 种依赖于Ca2+的具有自我切割功能的二级结构的脱氧核酶分子。San to ro和 Joyce等也通过体外选择技术提出了一种通用于RNA切割的脱氧核酶分子，它由 15个脱氧核苷酸构成催化特性结构域，两边分别连有7 8个脱氧核苷酸构成的 底物识别结构域。脱氧核酶也具有酶的基本特性，如催化效率高、底物专一性等。 它的催化效率决定于底物结合的速率，而它的专一性是酶底物以Watson2C rick 碱基配对形成二联体或三联体识别方式所决定的。另外，脱氧核酶的活性常依赖 一些二价金属

15、离子，如Mg2+、Zn2+、Cu2+、Pb2+、Ca2+和Mn2+等，每一种脱 氧核酶依赖的二价金属离子种类和程度都有差别，具有特异性。有些脱氧核酶还 能利用氨基酸或精胺作为辅助因子。现已发现的脱氧核酶有3种活性：连接酶活 性、金属螯合酶活性和磷酸酯酶活性。核酶和脱氧核酶的发现不仅打破了蛋白质 对生物催化剂的一统天下，而且还大大地促进了有关生命起源和生物进化等问题的进一步探讨。由于DNA和RNA集遗传信息储存传递作用和酶学催化作用于身， 因此生命起源的最新理论强调DNA和RNA这两类核酸物质的原始作用，也许生命 的早期起源及其生化机制是由核酸（包括DNA和RNA）开端的，其催化是自身催化。（一

16、）脱氧核酶的几种结构Carmi等通过体外选择技术合成了一种依赖Ca2+的具有自我切割功能的 手枪型二级结构脱氧核酶分子（图1）。茎N是结合部位，茎0是催化部位。结合 部位不同的碱基序列可以识别不同的底物；催化部位则相对保守。由于结合部位 碱基配对是催化剂识别底物的基础，延长茎N序列可以增加酶2底物复合物的 稳定性，但序列过长则会造成DNA分子自我构建（self2strueture）,降低茎0 催化部位的催化活性。主要切割位点在14，也可能通过氧化切割机制在偏离主 要位点的区域进行切割。46nierC5-GAATTCTAATACGAjTCAG “CTG AGTlAT I3rCA40to图1手枪型脱氧核酶分子Santoro和Joyce等通过体外选择技术提出了一种通用于RNA切割的脱氧 核酶分子（图2）。它由15个脱氧核苷酸构成催化特性结构域，两