《包涵体变性、复性及纯化》由会员分享,可在线阅读,更多相关《包涵体变性、复性及纯化(15页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌?细胞的破碎方法1. 高速组织捣碎:将材料配成稀糊状液,放置于筒内约1/3 体积,盖紧筒盖,将调速器先拨 至最慢处,开动开关后,逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。2. 玻璃匀浆器匀浆:先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细 胞研碎,此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高,适用于量少和动物脏器组织。3. 超声波处理法:用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用于 微生物材料,用大肠杆菌制备各种酶,常选用50-100毫克菌体/毫升浓度,在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟,此法的缺点是在处理过
2、程会产生大量的热,应采取相应降温措施, 时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整,超声完全了菌液应该变清亮,如果不放心 可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。4. 反复冻融法:将细胞在-20 度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩 余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。5化学处理法:有些动物细胞,例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等 细胞膜破坏,细菌细胞壁较厚,可采用溶菌酶处理效果更好,我用的浓度一般为1mg/ml。无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分 子生物降解,导致天然物质量的减少,
3、加入二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作 用;加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯甲磺酰氟化 物(PMSF)也能清除蛋白水解酶活力,但不是全部,而且应该在破碎的同时多加几次;另外, 还可通过选择pH、温度或离子强度等,使这些条件都要适合于目的物质的提取。这是标准配方:裂解液:50mM Tris-HCl(pH8.59.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg /ml溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用)但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的 话,尽
4、量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配 60ml 裂解液用药匙匙柄盛一 点就够. 判断裂解好坏的标准是,溶液很粘.protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体. 如果只做一个鉴定,我觉得1 00-200m l 菌就够了.但凡超声,我都用 60ml 裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种) 很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不 会洒出来. 菌多我就延长超声时间.沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解. 如果不上柱 ,只是跑跑电泳
5、,可以直接用 8M 尿素溶解以后 ,离心取上清 ,加入适量体积的 loading buffer.loading buffer 对于包涵体的溶解能力是较弱的.取200微升菌液,离心后直接加上样buffer,100度3分钟后上样,然后SDSPAGE.这个 方法到底能不能溶解细菌中的包涵体? 而楼主的问题,虽然 loading buffer 对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做 法只是在鉴定有无表达,用 loading buffer 是没有问题的.2、表达重组蛋白时,细菌裂解方法都有哪些?在表达重组蛋白时,诱导以后跑SDS-PAGE发现表达都很好,但是在裂解细胞时遇到问题。 总是不能彻底裂
6、解细胞。首先我采用超声裂解,可是不管我如何超声总有部分细菌没有裂解。我的超声条件如下:宁波新芝超声细胞破碎仪,功率400W,超5秒,间隔5秒,重复99次。 然后显微镜观察,不彻底时再重复99次。菌体来自200 ml培养液,用20 ml PBS重悬。然后我又尝试加溶菌酶,首先加至终浓度100 ug/ml, 4C 半小时菌液不变粘,加大浓度至 1 mg/ml,半小时后仍无明显变化。因为我用的PBS是pH7.4,我怀疑是pH不合适,换用 pH8.0 TE buffer, 1 mg/ml 溶菌酶, 4C 半小时仍无明显变粘。因为这次使用的溶菌酶是 前一天配好的,担心溶菌酶失效,重新称取冻干粉末,直接加
7、入菌液,仍然没有明显变化。 真是郁闷。到底出了什么事?请高手解答,并介绍优化的方案。同时希望能介绍一下如何选择细胞破碎方法,以及如何确定最佳条件。溶菌酶在 pH7.4 时是否没有活性了?可否配成浓缩液保存溶菌酶,如果可以,应如何保 存? 加入溶菌酶以后,如果细胞壁已破坏,菌液应该变粘吧,因为核酸被释放出来。 而超声破碎细胞,我觉得菌液是不会变粘的,因为超声可以把大分子核酸打碎成小片段。我判断细胞破碎不完全是因为,在将破碎后样品离心分离上清和沉淀跑SDS-PAGE观察,发 现在细胞碎片组分中除了经常出现的一两条带以外,还有菌体总蛋白样品中的很多带出现 据此可以判断细胞只是部分破碎。不知我的分析是
8、否正确,请版主和各位高手指教。如果溶菌酶效果还可以,我觉得先用溶菌酶初步裂解细胞,然后再用超声进一步破碎并断裂 大分子核酸以降低粘度的细胞破碎策略可能比较好。因为超声有可能使蛋白变性,但单用溶 菌酶不能确定是否完全破碎,还要再加核酸酶降低粘度。这种两步法策略应该还可以减少破 碎条件优化的时间。我用的溶菌酶放置时间比较长了,有可能失活了。我刚从生工又定了一支,不过得后天到货, 但愿它有用。如何观察溶菌酶是否已裂解细胞,通过观察粘度变化是否可以? 只反复冻融是否可以有效裂解大肠杆菌细胞?溶菌酶只有在pH值大于8.0的条件下才能发挥溶菌作用,请务必保持PBS的pH8.0,同 时溶菌酶的量一定要足!在
9、加入溶菌酶后,最好放于磁力搅拌器上搅拌30分钟,再进行超声破菌,我的超声条件是: 功率400W,工作2秒,间隔2秒,重复199次。菌体来自500 ml培养物,用30 ml PBS 重悬,超声效率还是可以的。哪儿的溶菌酶好用?我用 生工 的溶 菌酶 ,称 取干 粉 20mg。 200ml 菌液 用 18 ml NaCl 重悬 ,加 入2 ml 25mM Tris-HCI(pH8.0),将溶菌酶干粉加入体系,混匀,测pH降低到5_6,加 20 ul 2M Tris碱,体系pH升到8。4C放置1小时,菌液上层变澄清,摇动发现体系 没有变粘。测pH仍在8左右。再37C保温1小时,还没有变化,我简直不知
10、如何才好了。 另一瓶200ml培养物,溶菌酶处理1小时后超声。条件:300W,超5秒停5秒,重复99次。菌液有变化,但很不明显。继续超声 400 次,从外观来看没有太大区别。我简直要说 tmd 了。见鬼了。我的操作有什么地方不妥当,请各位指正。 溶菌酶的厂商要求是否很重要?我的诱导物来自1 :20过夜培养物接种,37C生长3小时后30C诱导2小时(0.8mM IPTG)。 是否菌液太浓,Pharmacia的说明书200 ml培养物用10 ml重悬,我用20 ml,仍然不 够稀?有人告诉我菌液应该稀一些,200 ml 用30_40 ml 重悬。但实际操作也不够理想。 SDS-PAGE总是观察到细
11、胞破碎效果不够彻底。超声那么多次,蛋白都要被超碎变性了。3、酵母的破碎 酵母是一类单细胞真菌的总称,其成员分别属于不同的真菌纲,细胞壁成分是否会有较大差 别,这些都是做破碎酵母细胞前要考虑的。我归纳了一下,做破碎酵母的几种方法:1机械的方法:一般的PROTOCOL都是用glass beads:如sigma G-8772,加玻璃珠后 超声,蛋白活性保持较好。2化学裂解的方法:10g酵母 加1ml的乙酸乙酯,充分搅拌至液体状(希望高手点评)3 尿素裂解液(尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH 值 8.0)高压
12、 匀浆。(这个好象也该在方法 2 中)4 液氮冻融并研磨酵母破壁,我认为这种可能在小试中比较合适。5 温和的酶法,可能不会会破坏酵母原生质体酶法裂解主要用两种酶:1。蜗牛酶,可以直接从蜗牛的胃液中获得;2。lyticase,可以从 sigma 定购。这两种酶解法都可以和上面的几种方法结合使用,尤其是 glass beads 方法, 效果很好。我用过化学裂解的方法,10g酵母加1ml的乙酸乙酯,充分搅拌至液体状。此法的裂解效 果不错的,不妨试一下。一 篇 文 章 是 加 尿素裂 解液( 尿 素8mol/L, NaCl0.5mol/L,Tris 20mmol/L,EDTA20mmol/L,2%SD
13、S,PH 值 8.0),据说效果可以酵母破碎效果好的我所做过的方法中还是玻璃珠,就象microbe和rongjunli所说的那样, 效率很高的,而且对目的蛋白活性不会有什么影响。一般应该用这个方法。4、超声破碎的条件选择 超声破碎的条件不能一概而论,要看你的实验要求,有的是细菌破碎,有的是对组织细胞进 行破碎,要掌握好功率和每次超声时间,功率大时,每次超声时间可缩短,不能让温度升高, 必要时在冰浴条件下进行超声破碎。至于每次超声时是否起泡沫到不是关键的问题,这与你 超声的量明显有关。5、如何鉴定细菌超声破碎的程度最简单的方法:涂片-革兰氏结晶紫溶液染色0.5 分钟-显微镜观察切记:只用结晶紫染
14、色,别忘了染色后再用水稍冲洗一下6、细菌裂解的 DNaseI 不同纯度的酶换算标准不同,所以你最好查查是哪个公司的酶?仔细看说明书,可能会有换 算说明。另外看一下参考文献所用的酶是哪个公司的,到该公司的主页也可能有收获。我用过华美和TAKARA的DNA酶,华美的是用mg/ml。华美也有RNase free的DNA酶,定 量用活性单位。TAKARA的两种酶都是用活性单位定量的。我在超声裂解细菌时加入一些DNA酶,一般用超声液加不同量的酶做一个预实验,选取符合 你需要的酶量。其实根据目的和方法的不同,所需要的酶量也是可调节的,比如酶切温度(16度或37度)。7、超声裂解细菌是否完全?最简单的方法:
15、涂片-革兰氏结晶紫溶液染色0.5 分钟-显微镜观察切记:只用结晶紫染色二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的,我以前是这么做的,先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分, 过滤除去未溶解的物质,注意留样跑电泳,然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电 泳,如此类推可以一直稀释到合适的浓度,你可以找到一个合适去除杂质的办法,其实这就 是梯度沉淀的方法,我觉得比通常的直接洗脱效果好。包涵体一般难溶解,所以你要注意未溶解的部分,你可以跑电泳对比,因为有时候难溶解的 就是你的目标蛋白,所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比,免得把目标蛋白弄丢了。此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后
16、难溶解,溶解也需要长点时间,也需要大量的溶剂 如果说是不少不溶解的不是你要的,那就不用管了。2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化,包涵体的前处理是很重要的。包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒DNA和其它杂 质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂,如Tween、Tri ton、Lubel和NP40等加EDTA和还原 剂2-巯基苏糖醇(DTT)、B-巯基乙醇等反复多次进行,因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度 升高而加强,在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上, 而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体 表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液