《包涵体变性、复性及纯化》由会员分享，可在线阅读，更多相关《包涵体变性、复性及纯化（15页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1. 高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3 体积，盖紧筒盖，将调速器先拨 至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。2. 玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细 胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。3. 超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于 微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过
2、程会产生大量的热，应采取相应降温措施， 时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心 可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。4. 反复冻融法：将细胞在-20 度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩 余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。5化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等 细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分 子生物降解，导致天然物质量的减少，
3、加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作 用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化 物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外， 还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。这是标准配方:裂解液：50mM Tris-HCl（pH8.59.0）, 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg /ml溶菌酶。（溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用）但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话，而且蛋白的分子量又小于20kd的 话,尽
4、量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配 60ml 裂解液用药匙匙柄盛一 点就够. 判断裂解好坏的标准是,溶液很粘.protocol是10ml-50ml缓冲液（菌体洗涤液，裂解液等）/1g湿菌体. 如果只做一个鉴定,我觉得1 00-200m l 菌就够了.但凡超声,我都用 60ml 裂解液,因为我们的超声仪（现代分子生物学实验技术录象里的那种） 很适合用100ml小烧杯，装60ml裂解液，这样能让超声头离液面不高不低，不会冒泡泡，也不 会洒出来. 菌多我就延长超声时间.沉淀,也就是包涵体沉淀了，如果要上柱纯化，一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解. 如果不上柱 ,只是跑跑电泳
5、,可以直接用 8M 尿素溶解以后 ,离心取上清 ,加入适量体积的 loading buffer.loading buffer 对于包涵体的溶解能力是较弱的.取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE.这个 方法到底能不能溶解细菌中的包涵体? 而楼主的问题,虽然 loading buffer 对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做 法只是在鉴定有无表达,用 loading buffer 是没有问题的.2、表达重组蛋白时，细菌裂解方法都有哪些？在表达重组蛋白时，诱导以后跑SDS-PAGE发现表达都很好，但是在裂解细胞时遇到问题。 总是不能彻底裂
6、解细胞。首先我采用超声裂解，可是不管我如何超声总有部分细菌没有裂解。我的超声条件如下：宁波新芝超声细胞破碎仪，功率400W,超5秒，间隔5秒，重复99次。 然后显微镜观察，不彻底时再重复99次。菌体来自200 ml培养液，用20 ml PBS重悬。然后我又尝试加溶菌酶，首先加至终浓度100 ug/ml， 4C 半小时菌液不变粘，加大浓度至 1 mg/ml，半小时后仍无明显变化。因为我用的PBS是pH7.4,我怀疑是pH不合适，换用 pH8.0 TE buffer， 1 mg/ml 溶菌酶， 4C 半小时仍无明显变粘。因为这次使用的溶菌酶是 前一天配好的，担心溶菌酶失效，重新称取冻干粉末，直接加
7、入菌液，仍然没有明显变化。 真是郁闷。到底出了什么事？请高手解答，并介绍优化的方案。同时希望能介绍一下如何选择细胞破碎方法，以及如何确定最佳条件。溶菌酶在 pH7.4 时是否没有活性了？可否配成浓缩液保存溶菌酶，如果可以，应如何保 存？ 加入溶菌酶以后，如果细胞壁已破坏，菌液应该变粘吧，因为核酸被释放出来。 而超声破碎细胞，我觉得菌液是不会变粘的，因为超声可以把大分子核酸打碎成小片段。我判断细胞破碎不完全是因为，在将破碎后样品离心分离上清和沉淀跑SDS-PAGE观察，发 现在细胞碎片组分中除了经常出现的一两条带以外，还有菌体总蛋白样品中的很多带出现 据此可以判断细胞只是部分破碎。不知我的分析是
8、否正确，请版主和各位高手指教。如果溶菌酶效果还可以，我觉得先用溶菌酶初步裂解细胞，然后再用超声进一步破碎并断裂 大分子核酸以降低粘度的细胞破碎策略可能比较好。因为超声有可能使蛋白变性，但单用溶 菌酶不能确定是否完全破碎，还要再加核酸酶降低粘度。这种两步法策略应该还可以减少破 碎条件优化的时间。我用的溶菌酶放置时间比较长了，有可能失活了。我刚从生工又定了一支，不过得后天到货， 但愿它有用。如何观察溶菌酶是否已裂解细胞，通过观察粘度变化是否可以？ 只反复冻融是否可以有效裂解大肠杆菌细胞？溶菌酶只有在pH值大于8.0的条件下才能发挥溶菌作用，请务必保持PBS的pH8.0,同 时溶菌酶的量一定要足！在
9、加入溶菌酶后，最好放于磁力搅拌器上搅拌30分钟，再进行超声破菌，我的超声条件是： 功率400W，工作2秒，间隔2秒，重复199次。菌体来自500 ml培养物，用30 ml PBS 重悬，超声效率还是可以的。哪儿的溶菌酶好用？我用 生工 的溶 菌酶 ，称 取干 粉 20mg。 200ml 菌液 用 18 ml NaCl 重悬 ，加 入2 ml 25mM Tris-HCI(pH8.0),将溶菌酶干粉加入体系，混匀，测pH降低到5_6，加 20 ul 2M Tris碱，体系pH升到8。4C放置1小时，菌液上层变澄清，摇动发现体系 没有变粘。测pH仍在8左右。再37C保温1小时，还没有变化，我简直不知
10、如何才好了。 另一瓶200ml培养物，溶菌酶处理1小时后超声。条件：300W,超5秒停5秒，重复99次。菌液有变化，但很不明显。继续超声 400 次，从外观来看没有太大区别。我简直要说 tmd 了。见鬼了。我的操作有什么地方不妥当，请各位指正。 溶菌酶的厂商要求是否很重要？我的诱导物来自1 ：20过夜培养物接种,37C生长3小时后30C诱导2小时(0.8mM IPTG)。 是否菌液太浓，Pharmacia的说明书200 ml培养物用10 ml重悬，我用20 ml，仍然不 够稀？有人告诉我菌液应该稀一些，200 ml 用30_40 ml 重悬。但实际操作也不够理想。 SDS-PAGE总是观察到细
11、胞破碎效果不够彻底。超声那么多次，蛋白都要被超碎变性了。3、酵母的破碎 酵母是一类单细胞真菌的总称，其成员分别属于不同的真菌纲，细胞壁成分是否会有较大差 别，这些都是做破碎酵母细胞前要考虑的。我归纳了一下，做破碎酵母的几种方法：1机械的方法：一般的PROTOCOL都是用glass beads:如sigma G-8772，加玻璃珠后 超声，蛋白活性保持较好。2化学裂解的方法:10g酵母 加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状(希望高手点评)3 尿素裂解液(尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH 值 8.0)高压
12、 匀浆。(这个好象也该在方法 2 中)4 液氮冻融并研磨酵母破壁，我认为这种可能在小试中比较合适。5 温和的酶法，可能不会会破坏酵母原生质体酶法裂解主要用两种酶：1。蜗牛酶，可以直接从蜗牛的胃液中获得；2。lyticase，可以从 sigma 定购。这两种酶解法都可以和上面的几种方法结合使用，尤其是 glass beads 方法， 效果很好。我用过化学裂解的方法，10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状。此法的裂解效 果不错的，不妨试一下。一 篇 文 章 是 加 尿素裂 解液( 尿 素8mol/L, NaCl0.5mol/L,Tris 20mmol/L,EDTA20mmol/L,2%SD
13、S,PH 值 8.0)，据说效果可以酵母破碎效果好的我所做过的方法中还是玻璃珠，就象microbe和rongjunli所说的那样， 效率很高的，而且对目的蛋白活性不会有什么影响。一般应该用这个方法。4、超声破碎的条件选择 超声破碎的条件不能一概而论，要看你的实验要求，有的是细菌破碎，有的是对组织细胞进 行破碎，要掌握好功率和每次超声时间，功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高， 必要时在冰浴条件下进行超声破碎。至于每次超声时是否起泡沫到不是关键的问题，这与你 超声的量明显有关。5、如何鉴定细菌超声破碎的程度最简单的方法：涂片-革兰氏结晶紫溶液染色0.5 分钟-显微镜观察切记：只用结晶紫染
14、色，别忘了染色后再用水稍冲洗一下6、细菌裂解的 DNaseI 不同纯度的酶换算标准不同，所以你最好查查是哪个公司的酶？仔细看说明书，可能会有换 算说明。另外看一下参考文献所用的酶是哪个公司的，到该公司的主页也可能有收获。我用过华美和TAKARA的DNA酶，华美的是用mg/ml。华美也有RNase free的DNA酶，定 量用活性单位。TAKARA的两种酶都是用活性单位定量的。我在超声裂解细菌时加入一些DNA酶，一般用超声液加不同量的酶做一个预实验，选取符合 你需要的酶量。其实根据目的和方法的不同，所需要的酶量也是可调节的，比如酶切温度（16度或37度）。7、超声裂解细菌是否完全？最简单的方法：
15、涂片-革兰氏结晶紫溶液染色0.5 分钟-显微镜观察切记：只用结晶紫染色二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分， 过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电 泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就 是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的 就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后
16、难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂 如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。包涵体中主要含有重组蛋白，但也含有一些细菌成分，如一些外膜蛋白、质粒DNA和其它杂 质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Tri ton、Lubel和NP40等加EDTA和还原 剂2-巯基苏糖醇（DTT）、B-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度 升高而加强,在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上， 而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体 表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液
