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1、蛋白纯化答疑By aqiao 发表于 2007-4-15 18:38:00 凝胶过滤层析 也叫做分子排阻层析。一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。 关键是不知道你用什么凝胶过滤层析。一般来说大部分细菌比蛋白质小，要看是什么的凝胶过滤层析，才能达到材料上的阻挡。 响凝胶过滤层析的多种因素 很多人以为凝胶过滤非常简单直接，无需花太多精神仔细优化。其实影响凝胶过滤的参数非常多，现与大家分享几点经验： 1 层析柱必须有柱头及分布器，即adaptor，紧压胶面完合没有空隙，否则样品上样受影响。 2 凝胶悬浮液不可太稠，否则很容易出气泡；太稀装柱时间过长，亦影响效果
2、。50- 70%较适合。若是干粉，溶胀时间必须充足。装前完全搅匀。 3 一次性倒入层析柱中，容量不够则需加装柱器。切不可分几次倒，柱效和对称性都很难合格。 4 装柱及层析工作所用缓冲液的温度需一样。 5 柱底网下的气泡一定要除掉，可先用20%乙醇湿一下底网。 6 每种胶在不同柱高下的装柱流速、压力都不一样。跟足介质说明书的指引就万无一失了！找不到查AKTA系统的 Unicorn 中主屏幕的 adviser 即可，也可以查这光盘上有关层析凝胶的操作手册。 7 上样前柱平衡非常重要，不光UV平稳，至少平衡一个柱体积。 8 缓冲液pH值会影响分离效果，经验中用pH7.0和pH4.5的缓冲液分离5个低
3、分子量标准蛋白，结果颇有不同。 9 加入0.15M NaCl可防止非特异性的吸附及蛋白间的聚合。 如果在适当期间加入不同的材料可以有效的防止对应的细菌。 老兄，我新手哈，只能给你这么多的了。 http:/ 这个网站可以稍微帮你点参考，但是得全综合来总结，我就不方便全部总结了！ 请多支持我哈，个人感觉你的问题太简单了。不好针对性的回答，不可能把所有的情况说出来再分析吧？！ 回答者：janefeng1986 - 试用期 一级 3-23 01:52同意楼上的说法 回答者：菜刀狗狗 - 助理 三级 3-25 18:25一、菌体的裂解 1、怎样裂解细菌？ 细胞的破碎方法 1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊
4、状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全
5、了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。 无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋
6、白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 这是标准配方: 裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.59.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用) 但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的
7、标准是,溶液很粘. protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体. 如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了. 但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间. 沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loading buffer.loading buffer对于包涵体
8、的溶解能力是较弱的. 取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE. 这个方法到底能不能溶解细菌中的包涵体? 而楼主的问题,虽然loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做法只是在鉴定有无表达,用loading buffer是没有问题的. 2、表达重组蛋白时，细菌裂解方法都有哪些？ 在表达重组蛋白时，诱导以后跑SDS-PAGE发现表达都很好，但是在裂解细胞时遇到问题。总是不能彻底裂解细胞。 首先我采用超声裂解，可是不管我如何超声总有部分细菌没有裂解。 我的超声条件如下：宁波新芝超声细胞破碎仪，功率400W，超5秒，间隔5
9、秒，重复99次。然后显微镜观察，不彻底时再重复99次。菌体来自200 ml培养液，用20 ml PBS重悬。 然后我又尝试加溶菌酶，首先加至终浓度100 ug/ml，4C半小时菌液不变粘，加大浓度至1 mg/ml，半小时后仍无明显变化。因为我用的PBS是pH7.4，我怀疑是pH不合适，换用pH8.0 TE buffer，1 mg/ml溶菌酶，4C半小时仍无明显变粘。因为这次使用的溶菌酶是前一天配好的，担心溶菌酶失效，重新称取冻干粉末，直接加入菌液，仍然没有明显变化。 真是郁闷。到底出了什么事？请高手解答，并介绍优化的方案。 同时希望能介绍一下如何选择细胞破碎方法，以及如何确定最佳条件。 溶菌酶
10、在pH7.4时是否没有活性了？可否配成浓缩液保存溶菌酶，如果可以，应如何保存？ 加入溶菌酶以后，如果细胞壁已破坏，菌液应该变粘吧，因为核酸被释放出来。 而超声破碎细胞，我觉得菌液是不会变粘的，因为超声可以把大分子核酸打碎成小片段。 我判断细胞破碎不完全是因为，在将破碎后样品离心分离上清和沉淀跑SDS-PAGE观察，发现在细胞碎片组分中除了经常出现的一两条带以外，还有菌体总蛋白样品中的很多带出现。据此可以判断细胞只是部分破碎。 不知我的分析是否正确，请版主和各位高手指教。 如果溶菌酶效果还可以，我觉得先用溶菌酶初步裂解细胞，然后再用超声进一步破碎并断裂大分子核酸以降低粘度的细胞破碎策略可能比较好
11、。因为超声有可能使蛋白变性，但单用溶菌酶不能确定是否完全破碎，还要再加核酸酶降低粘度。这种两步法策略应该还可以减少破碎条件优化的时间。 我用的溶菌酶放置时间比较长了，有可能失活了。我刚从生工又定了一支，不过得后天到货，但愿它有用。 如何观察溶菌酶是否已裂解细胞，通过观察粘度变化是否可以？ 只反复冻融是否可以有效裂解大肠杆菌细胞？ 溶菌酶只有在pH值大于8.0的条件下才能发挥溶菌作用，请务必保持PBS的pH8.0，同时溶菌酶的量一定要足！ 在加入溶菌酶后，最好放于磁力搅拌器上搅拌30分钟，再进行超声破菌，我的超声条件是：功率400W，工作2秒，间隔2秒，重复199次。菌体来自500 ml培养物，
12、用30 ml PBS重悬，超声效率还是可以的。 哪儿的溶菌酶好用？ 我用生工的溶菌酶，称取干粉20mg。200ml菌液用18 ml NaCl重悬，加入2 ml 25mM Tris-HCl(pH8.0)，将溶菌酶干粉加入体系，混匀，测pH降低到56，加20 ul 2M Tris碱，体系pH升到8。4C放置1小时，菌液上层变澄清，摇动发现体系没有变粘。测pH仍在8左右。再37C保温1小时，还没有变化，我简直不知如何才好了。 另一瓶200ml培养物，溶菌酶处理1小时后超声。条件：300W，超5秒停5秒，重复99次。菌液有变化，但很不明显。继续超声400次，从外观来看没有太大区别。我简直要说tmd了。
13、见鬼了。 我的操作有什么地方不妥当，请各位指正。 溶菌酶的厂商要求是否很重要？ 我的诱导物来自1：20过夜培养物接种，37C生长3小时后30C诱导2小时（0.8mM IPTG）。 是否菌液太浓，Pharmacia的说明书200 ml培养物用10 ml重悬，我用20 ml，仍然不够稀？有人告诉我菌液应该稀一些，200 ml用3040 ml重悬。但实际操作也不够理想。 SDS-PAGE总是观察到细胞破碎效果不够彻底。超声那么多次，蛋白都要被超碎变性了。 3、酵母的破碎 酵母是一类单细胞真菌的总称，其成员分别属于不同的真菌纲，细胞壁成分是否会有较大差别，这些都是做破碎酵母细胞前要考虑的。我归纳了一下
14、，做破碎酵母的几种方法： 1 机械的方法：一般的PROTOCOL都是用glass beads：如 sigma G-8772，加玻璃珠后超声，蛋白活性保持较好。 2 化学裂解的方法：10g酵母 加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状（希望高手点评） 3 尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0）高压匀浆。（这个好象也该在方法2中） 4 液氮冻融并研磨酵母破壁，我认为这种可能在小试中比较合适。 5 温和的酶法，可能不会会破坏酵母原生质体 酶法裂解主要用两种酶：1。蜗牛酶，可以直接从蜗牛的胃液中获
15、得；2。lyticase，可以从sigma定购。这两种酶解法都可以和上面的几种方法结合使用，尤其是glass beads方法，效果很好。 我用过化学裂解的方法，10g酵母 加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状。此法的裂解效果不错的，不妨试一下。 一篇文章是加尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0），据说效果可以 酵母破碎效果好的我所做过的方法中还是玻璃珠，就象microbe 和rongjunli所说的那样，效率很高的，而且对目的蛋白活性不会有什么影响。一般应该用这个方法。 4、超声破碎的条件选择 超声破碎的条件不能一概而论，要看你的实验要求，有的是细菌破碎，有的是对组织细胞进行破碎，要掌握好功率和每次超声时间，功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，必要时在冰浴条件下进行超声破碎。至于每次超声时是否起泡沫到不是关键的问题，这与你超声的量明显有关。 5、如何鉴定细菌超声破碎的程度 最简单的方法：涂片-革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟-显微镜观察 切记：只用结晶紫染色，别忘了染色后再用水稍冲洗一下 6、细菌裂解的DNaseI 不同纯度的酶换
