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1、PI 染 色荧光染料 PI（碘化丙啶）是一种可对 DNA 染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是 Propidium Iodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链 DNA 后释放红色荧光。尽管 PI 不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI 经常被用来与 Calcein-AM 或者 FDA 等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。PI-DNA 复合物的激发和发射波长分别为535 nm 和615 nm。PI 可以用来进行活细胞、死细胞的双重染色钙黄绿素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)溶液，它们分别可对活细胞和死细胞染色。Calcein-
2、AM 的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜。尽管Calcein -AM 本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein -AM 能脱去 AM 基，产生的 Calcein 能发出强绿色荧光（激发：490 nm，发射：515 nm）。因此 Calcein -AM 仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的 PI 不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的 DNA 双螺旋从而产生红色荧光（激发：535nm，发射：617nm）。由于 Calcein 和 PI-DNA 都可被490nm 激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm 激发
3、，仅可观察到死细胞。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，我们建议个别确定 PI 和 Calcein -AM 的合适浓度。I. 试剂Calcein-AM PIII. 用荧光显微镜观察细胞形态以 HeLa 细胞染色为例,请注意不同的细胞种类、不同浓度有不同的观察条件。根据细胞条件，摸索不同条件下的细胞贴壁情况和试剂浓度的配制等最佳条件。染色溶液的配制1） 用1 ml 无水DMSO 溶解1 mg Calcein-AM，制备成1 mmol/l 的Calcein-AM 储备液，- 20下密闭冷冻保存。2） 用1 ml ddH2O 溶解1 mg PI，制备成1.5 mmol/l 的 PI 储备液（1 mg
4、PI/1 ml H2O），-20下密闭冷冻保存。3） 将 Calcein-AM 储备液和 PI 储备液放置于室温。4） 加10 l Calcein-AM 储备液和15lPI 储备液至5 ml PBS 中配制成染色溶液。Calcein-AM 的终浓度为2 moll，PI 的终浓度为4moll。2. 细胞染色1） 染色 HeLa 细胞等贴壁细胞时,先用 Trypsin-EDTA 等消化细胞，制备成细胞悬液。2） 将细胞悬液离心3分钟(1,000 rpm)。3） 去除上清液，加入 PBS 缓冲液，细胞数量调整至105 106 个ml。再用移液器充分混匀。4） 由于培养基中的血清等含有酯酶，Calce
5、in-AM 遇水会分解，会导致空白上升，所以需要离心数次，用 PBS 洗涤数次直到完全洗净。5） 将200 l 细胞悬液移至小试管中，加入100 l 染色溶液，在37下孵育15分钟。6） 在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。7） 在荧光显微镜下，先使用49010 nm 波长激发，观察黄绿色的活细胞，还可以同时观察到红色的死细胞，然后用545 nm 波长激发，能够看到红色的死细胞。*在荧光显微镜下观察时，如果背景高，可以用培养基清洗掉细胞外的染料后再观察。*Calcein-AM 溶液和 PI 溶液可以混合在一起染色，也可以分开进行染色，加入的先后顺序没有影响。7）在荧光显微镜下，先使用49010
6、 nm 波长激发，观察黄绿色的活细胞，还可以同时观察到红色的死细胞，然后用545 nm 波长激发，能够看到红色的死细胞。*在荧光显微镜下观察时，如果背景高，可以用培养基清洗掉细胞外的染料后再观察。*Calcein-AM 溶液和 PI 溶液可以混合在一起染色，也可以分开进行染色，加入的先后顺序没有影响。3. 染色试剂的最佳浓度Calcein-AM 和 PI 的最适浓度是根据不同的细胞种类而定，通过以下的操作，我们可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓度。1） 通过在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中孵育10分钟或通过在70%乙醇中孵育30分钟制备死细胞。2） 用0.1-10 M 的 PI 溶液
7、对死细胞染色，以便找到仅对细胞核染色而不对细胞质染色的 PI 浓度。3） 用0.1-10 M 的 Calcein-AM 溶液对死细胞染色，以便找到不对细胞质染色的 Calcein -AM 浓度。接着用该浓度的 Calcein -AM 对活细胞染色以检验活细胞可否被染色。III. 注意事项1） Calcein-AM 的 ester 部位遇到湿气会分解，使用后请在-20下密闭冷冻保存，防止水分进入。Calcein-AM 储备液用缓冲液或培养基等稀释时尽量现配现用。2） PI 溶液在冷冻的条件下可以保存一年。PI 有引致癌的可能性,请在使用时注意以下3点。 使用时一定要带手套、眼罩、口罩。 万一接触
8、到皮肤的话，迅速使用大量水清洗。 处理方法使用器具的洗涤液等废液请按照不同的处理方法来处理，或者按照如下的处理方法，分解后再丢弃。用 UV 照射或光照分解。用次氯酸钠氧化分解后，做中和处理。染色例：“”“”At the end, Xiao Bian gives you a passage. Minand once said, people who learn to learn are very happy people. In every wonderful life, learning is an eternal theme. As a professional clerical and t
9、eaching position, I understand the importance of continuous learning, life is diligent, nothing can be gained, only continuous learning can achieve better self. Only by constantly learning and mastering the latest relevant knowledge, can employees from all walks of life keep up with the pace of enterprise development and innovate to meet the needs of the market. This document is also edited by my studio professionals, there may be errors in the document, if there are errors, please correct, thank you!
