第四篇 第一章发酵过程的中间控制总论

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1、发酵过程的中间控制发酵过程控制是发酵的重要部分 控制难点：过程的不确定性和参数的非线性 发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次 发酵过程的种类 分批培养 补料分批培养 半连续培养 连续培养分批发酵简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气 的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数 都随时间变化。A s=o。a-qejoQqulnu 60JTime 微生物生长分为：迟滞期、对数生长期、稳定期和死亡期 对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累，而次级代谢产 物则在对数生长期后期和稳定期大量合成。分批培养的优缺点优点 操作简单，周期短，染菌机

2、会少，生产过程和产品质量容易掌握 缺点 产率低，不适于测定动力学数据补料分批培养 在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积 比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多。 补料分批培养的优缺点优点 在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的 阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利 用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。缺点 由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于 有物料的加入增加了染菌机会 半连续培养在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半 连续培养。优点 放掉部分发酵液，再补

3、入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于 产物合成，提高了总产量。缺点 代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大连续培养 发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积 维持恒定。达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定 的。连续培养的优缺点优点 控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。由于n =D，通过改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学缺点 菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时 间补料染菌机会大大增加。发酵过程工艺控制的目的 有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发 挥出来目标

4、是得到最大的比生产速率和最大的生产率发挥菌种的最大生产潜力考虑之点菌种本身的代谢特点 生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、 代谢速率菌代谢与环境的相关性 温度、pH、渗透压、离子强度、溶氧浓 度、剪切力等发酵过程研究的方法和层次1、研究方法单因子实验：对实验中要考察的因子逐个进行试验，寻找每个因子的最佳 条件。一般用摇瓶做实验优点 一次可以进行多种条件的实验，可以在较快时间内得到的结果。 缺点 如果考察的条件多，实验时间会比较长 各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准确性数理统计学方法：运用统计学方法设计实验和分析实验结果，得到最佳的 实验条件。如正交设计、均匀设计、响应面设计。优点

5、同时进行多因子试验。用少量的实验，经过数理分析得到单因 子实验同样的结果，甚至更准确，大大提高了实验效率。但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的最佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中存在较大的误差就会得出错误的结果。2、研究的层次初级层次的研究： 一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株生长和代谢的一般条件，如 培养基的组成、最适温度、最适pH等要求。摇瓶研究的优点是工作量大，可以一次试验几十种甚至几百种条件，对于 菌种培养条件的优化有较高的效率。代谢及工程参数层次研究： 一般在小型反应器规模进行试验。在摇瓶试验的基础上，考察溶氧、搅拌 等摇瓶上无法考察的参数，以及在反应器中微生物对各

6、种营养成分的利用 速率、生长速率、产物合成速率及其它一些发酵过程参数的变化，找出过 程控制的最佳条件和方式。由于罐发酵中全程参数的是连续的，所以得到 的代谢情况比较可信。牛产规模放大：在大型发酵罐规模进行试验。将小型发酵罐的优化条件在大型反应器上得 以实现,达到产业化的实现。发酵过程的中间分析 代谢参数按性质分可分三类： 物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、 排气氧（二氧化碳）浓度等化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等 生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速 率、关键酶活力等从检测手段分可分为：直接参数、间接参数直

7、接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH、残糖间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、KLa等 直接参数又可分为在线检测参数和离线检测参数 在线检测参数指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温 度、pH、搅拌转速；离线检测参数指取出样后测定得到的参数，如残糖、NH2-N、菌体浓度发酵过程主要分析的项目目前发酵过程主要分析项目如下1、pHpH 与微生物的生命活动密切相关 酶催化活性pH的变化又是微生物代谢状况的综合反映一一基质代谢、产物合成、 细胞状态、营养状况、供氧状况2、排气氧、排气 CO2 和呼吸熵 排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用以后还剩余的

8、氧，因此排气氧 的大小反映了菌生长的活性，通过计算可以求得摄氧率（OUR）。CER表示单位体积发酵液单位时间内释放的二氧化碳的量呼吸熵=RQCEROUR呼吸熵反映了氧的利用状况RQ 值随微生物菌种的不同，培养基成分的不同，生长阶段的不同而不同 测定 RQ 值一方面可以了解微生物代谢的状况，另一方面也可以指导补料 一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态， 在营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。对于这 种工艺，后期的补料控制是关键。过程中发现，在补糖开始时，不但 CER、OUR大幅度提高，连RQ也提高约10%,表明通过补糖不但提供了更多的 碳源，而且随

9、着体系内葡萄糖浓度提高，糖代谢相关酶活力也提高，产能 增加。3、糖含量 微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。糖的消耗 反映产生菌的生长繁殖情况 反映产物合成的活力通过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节pH，促进 产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。糖含量测定包括总糖和还原糖。总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、单 糖等各种糖。还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。4、氨基氮和氨氮氨基氮指有机氮中的氮（NH2-N）,单位是mg/100m 1。如氨基酸中的氮， 黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。氨氮指无机氨中的氮（N H3-N）。 氮利用快慢可

10、分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制， 因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时 采取补氨措施。发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程。5、磷含量 微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量 的是磷酸根。磷是核酸的组成部分，是高能化合物ATP的组成部分，磷还能促进糖代谢。 因此磷在培养基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取补磷措施。 菌浓度和菌形态菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。菌形态 显微镜观察菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量的变化，一般前期菌 浓

11、增长很快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量补 料量适合与否的一个参数。菌浓测定方法测粘度压缩体积法（离心） 静置沉降体积法 光密度测定法 OD600660 适合于细菌、酵母 产物浓度产物量的测定 产物量的特殊表示法1、抗生素效价的表示 抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，效价大小用单位（U）来表示 效价表示方法：重量折算法重量单位类似重量单位特殊单位重量折算单位：以最低抑菌浓度为一个单位，如青霉素0.6微克=1U重量单位：规定某些抗生素活性部分1p g=1u如链霉素、卡那霉素、红 霉素等定义活性部分1p g=1u类似重量单位：规定抗生素的某种盐1mg=1000u如金霉素、四

12、环素的盐酸 盐定一为1p g=1u特殊单位：药检所制定某些抗生素的单位制霉菌素 1mg=3700u多粘菌素 B 1mg=10000u2、酶活力的表示法 酶活力用单位来表示。由于酶通常不是很纯，不能用重量来表示酶的量。 同一种酶用不同的方法测定会有不同的酶活单位，容易造成混乱，为此国 际上作了统一规定，规定在 250C 下，以最适的底物浓度，最适的缓冲液 离子强度，以及最适的 pH 诸条件下，每分钟能转化一微克分子底物的酶 定量为一个活性单位。3、产物量的测定1、化学法1）滴定法产物能使一定指示剂变色来指示反应终点的可用滴定法青霉素如7量七T青霉噻唑酸碘 叫S2O3滴定多余-I2T计算青霉素效价

13、（2）比色法 产物经一定化学反应产生颜色，且颜色深浅与产物浓度成正比，可以用比 色法测定。淀粉酶活力测定：在 1%可溶性淀粉溶液中加入淀粉酶，所释放出的麦芽 糖与生色试剂（3， 5-二硝基水杨酸与酒石酸钾钠的碱溶液）产生颜色，它 在 540nm 处所得吸光度跟淀粉酶活力成正比。（3）测压法产物特定反应放出或摄入气体，使系统有压力变化，可以通过测定压力变化得知产物量。谷氨酸_谷氨酸脱氢理_一 y 氨基丁酸+ CO2 2、物理法许多酶、抗生素都有不对称碳原子，具有旋光性，因此可以通过测定 旋光度来测定酶或抗生素的含量。化学和物理方法优点：快速、方便，经常用于过程分析 缺点产品中存在的杂质会干扰测定

14、结果，因此抗生素成品的测定用生物法 测定。3、生物法适用于抗生素效价的测定常用的生物法测定抗生素，采用杯碟法“杯”是放被测抗生素的不锈钢小管，小管内径为6mm,高10mm的圆筒形 管子，管子的重量尽可能相等。碟是摊布培养基的玻璃培养皿。 操作方法是：将已灭菌的琼脂培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，每 碟15m 1（下层），待其凝固。此外，将融化的培养基冷却到500C左右混入 试验菌，将混有菌的培养基5 ml加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。在培养基表面垂直放上小杯，在杯中加入待检样品，加满后在 370C 培养 1618小时。在培养中,一方面试验菌开始生长另一方面抗生素呈球面扩散， 离杯越近

15、，抗生素浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小。随着抗生素浓度 减小，有一条最低抑菌浓度带，在带范围内，菌不能生长，而呈透明的圆 圈，这就叫“抑菌圈”。抗生素浓度越高，抑菌圈越大，抑苗区图1T管碗法测定抗生索放射状扩散示总图r: 抑菌圈的半径（毫米，M：抗生素在管中的量（单位）C：最低抑菌浓度（单位/毫升）H：培养基的厚度（毫米）L：管子的高度（毫米）D：抗生素的扩散系数（毫米/小时）T:细菌生长到肉眼所用的时间（小时，抗生素浓度与抑菌圈的半径成一定数学关系1ogM=（1/9.21DT）r2+1og（C.4 n DTH）抗生素的总量的对数值与抑菌圈半径的平方呈正比。此外还受 C、H、D、T 的影响但是C、H、D、T是无法测量的，在实际计算中要设法消去 一般的消去方法有二剂量法标准曲线法两剂量法:已知:1loo Ar = ()UH + loo(C-9.21DT 丹1 9logAf = ()5h2 + log(C ADTH) I log 心(莎5f)S+ log(C4-D77/)样品高单位 总量:M， 抑菌圈半径切样品低单位 总量:nT 抑菌圈半径：UL标准品低单位 总量:m抑菌圈