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1、生物化学大实验结题报告BAP 的诱导、分离纯化及其功能的检测学生姓名学号 年级 专业 指导教师 完成时间BAP 的诱导、分离纯化及其功能的检测摘 要：BAP能催化核酸分子脱掉5磷酸基团，是分子生物学中常用的底物专 一性低的磷酸单酯酶。将BAP克隆在含有lac启动子的表达载体中，在培养基中 加入诱导物IPTG （异丙基硫代-0 -D-半乳糖）可使得阻遏蛋白不能与操纵基因 结合，让其在 E-coli 中大量转录并表达。对细菌进行超声波破碎以后用亲和层 析柱对其进行分 离纯化 ， 对其表 达 的 蛋 白 进行 SDS-PAGE 检测和 Western-blotting,用作特性分析。最后通过与BAP
2、标准样品的比较计算出其活 力。关键词：BAP；分离纯化；SDS-PAGE； Western-blotting细菌性碱性磷酸酶属于同源二聚体蛋白，分子量为56KDa。每个单体由449 个氨基酸组成，完整的AKP分子呈现典型的a /0的拓扑结构，同时每个单体均 具有一个活性中心。细菌性碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即 通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟 基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷 酸化或脱磷酸化。其最适pH是8.0。本实验技术路线：重组蛋白的诱导表达f重组蛋白的亲和层析纯化重组蛋白 的分子筛排阻层析纯化f
3、 SDS-PAGE电泳及Western-blot鉴定重组蛋白f重组蛋 白活性的检测。1 材料与方法1.1 菌种及实验用相关试剂大肠杆菌工程菌株BL21（DE3）,由生化实验室提供。葡聚糖G-75干粉、Tris-HCl、NaCl、标准蛋白、IPTG （异丙基硫代-0 -D-半乳 糖）、starting buffer、咪唑、Marker、PVDF 膜、TBS、吐温、一抗、酶标二抗， 均由生化实验室提供。其它生化试剂和常规试剂均为分析纯。1.2 装柱及标准样品的分子筛层析把柱子固定在夹子上，打开上面的盖，用取液器匀速加入介质。保证介质均 匀沉淀，且要缓慢加入，防止产生气泡。待介质完全沉降打开柱的上盖
4、，剪一与 柱内径大小一致的圆形滤纸片放入柱中，沉淀于介质表面。液体接近界面时加入 3ml超纯水，同时在层析杯中加入100ml超纯水，连接泵洗柱15min,同时配制 平衡液 400mL （80mmol Tris-HCl,pH 8.0; 8mmol NaCl）。待液体接近界面时， 在柱中加入3ml平衡液（其余平衡液加到层析杯中），调节流速，控制滴速为 3ml/10min （分钟约6-7滴）。平衡柱过中午。缓慢向柱中加入样品lml （牛血清蛋白（68kd）、糜蛋白酶（25kd）二者比例 为 2:1，溶于 200mmol Tris-HCl， pH 8.0; 20mmol NaCl）打开层析柱上端及下
5、端的连接管，使样品靠重力流出。当样品接近界面时，在柱中加入3ml上样缓 冲液，连接泵，调T=100 A（0.5A）=0,开启记录仪，同时配制100ml 0.1MNacl。 待两个峰都出来后，把层析杯中的液体换为0.1M Nacl洗柱20min，再用超纯水 洗柱30min,圭寸柱，关机。1.3BAP 的诱导表达首先进行预培养在5mlLB培养基中加入Amp 5p l和10p l菌液。在摇床上37C130转过夜预培养。取2.5ml菌液加入50mlLB培养基（含有50l Amp）， 1:20扩培。37C恒温摇床，190rpm培养40min。当OD60o值达到0.50.7时，进 行诱导表达，即加入工作浓
6、度为1mM的IPTG（500ul）进行外源基因的诱导表达。 于室温诱导 5 小时。留样 1ml ，其余放入冰箱于4度保存。1.4 超声波破碎诱导后的菌体，5000rpm离心15min，弃上清。加入1/10体积的破碎缓冲液 洗涤。5000rpm离心15min去上清，加入破碎缓冲液及终浓度为50l/5ml的溶 菌酶。30C温浴15min。然后分装于小离心管中，每管0.5ml。在冰浴条件下，60%功率超声处理4min。每五管一组，放于冰浴中连续处理， 每管4秒，再重复，直到处理4min为止。再用40%功率超声处理4min。超声要 求a将菌液处理至清亮；b始终保持低温环境；c避免出现黑色沉淀。将超声处
7、理后的样品于4C 2000rpm离心lOmin,沉淀为细胞碎片弃去。上 清再于4C 12000rpm离心lOmin。上清为可溶性蛋白，沉淀为包涵体。包涵体 留样lml，可溶性蛋白留样1001。l.5 亲和层析每柱中装 1.5ml 的介质、乙醇混合液。打开底下的帽，待液体滴至界面时加 超纯水洗5遍，然后加约4ml的starting buffer， 5遍平衡柱。待液体接近界 面时，用取液器将全部可溶性蛋白样品加入亲和柱。上柱2 次。待样品流到界面 时，用含10mM咪唑的淋洗液洗10柱体积。用3ml含有300mM咪唑的洗脱液洗脱， 并且用epp管收集每管5001。留样1001其余的洗脱样品用于分子筛
8、层析。 1.6BAP 的分子筛排阻层析亲和层析的样品第2、3、4管分别取400M混匀于1.5ml离心管中上柱，重 力使之渗入柱子。样品接近界面时，加入1ml起始缓冲液。打开泵开始收集（加 样时即打开读纸器），在峰顶处留样测定酶活。关读纸机。然后用 20ml0.1MNacl 的处理柱子。洗柱，用超纯水洗30min左右。1.7 SDS-PAGE检测和Western-blotting检测目的蛋白样品处理包涵体处理：在留样的沉淀中加入500l 8M的尿素，摇匀。取20l于1.5ml离心管中，再加入50l上样缓冲液，于100C沸水中煮沸5min。 0菌体处理：将留样的1ml菌体于12000rpm离心1m
9、in，用滤纸吸干残液，用100 l上样缓冲液重悬菌体，100C沸水中煮沸5min0亲和层析样品处理：取亲 和层析样品,2和3号管各20】于1.5ml离心管中，再加入20】上样缓冲液， 于100C沸水中煮沸5min。待样品冷却后12000rpm离心5min。清洗电泳槽，玻璃板，胶条等电泳装置，然后用滤纸轻轻吸水晾干。组装玻 璃板（凹面向外），封胶条要贴紧玻璃板，胶条下端要平直，并且胶条始终要自 然弹性范围不要用力拽。准备一个小烧杯，配制12%的分离胶，混匀后立即用取 液器加入玻璃板中，加至红线处。再加入1ml的超纯水，静置30min。待胶凝固 后倾斜倒出超纯水。用滤纸吸干残液。配制 5%浓缩胶，
10、混匀后立即加入插上梳 子的玻璃板面，直至没过柱子与玻璃板凹面相平。静置30min。待浓缩胶凝固后 垂直拔下梳子，取出玻璃板，除去胶条，使玻璃板凹面向内重新组装，然后向内 外槽加入电极缓冲液。按顺序依次点样，两块胶一块做 SDS 染色（普通 Marker）， 另一块做 western 杂交（点预染 Marker）。 Marker 要提前处理。将电泳装置与电泳电源连接。调电压60V。待溴酚蓝前沿进入分离胶后，换 成 90V 电压，直到溴酚蓝前沿跑出胶，再过半小时，关闭电源停止电泳。电泳完 毕后，卸下玻璃板，小心撬开。用手术刀切去浓缩胶。将点有普通 Marker 的胶 浸泡在染色液中。染色一脱色一水
11、洗（过夜）。预染Marker的胶进行转膜处理。清洗转移电泳槽等装置。蒸馏水漂洗点有预染 Marker 的胶。然后浸泡在转 移缓冲液中。戴上手套用镊子夹住PVDF膜。先在甲醇中精确处理15秒。然后放 入蒸馏水槽中漂洗一下，最后放于盛有转移缓冲液的盆中平衡15min。同时将4 片滤纸2 块海绵浸泡在转移缓冲液中。尽量用玻璃棒赶去海绵中的气泡（否则易 短路）。按照阴极黑板一海绵垫一2层滤纸一凝胶一PVDF膜一2层滤纸一海绵垫 阳极红板的顺序装80mA恒流下在转移电泳槽中冰浴电泳2.5小时。取出PVDF 膜放于干燥滤纸上片刻，但不要吸干膜。灭菌去离子水中冲洗。将PVDF膜放入玻璃平皿中加入封闭液（lO
12、mlTBS, 10ml, 0.25g脱脂奶粉）， 在摇床上封闭2小时。取出PVDF膜，在1XTBS中漂洗2次后放入平皿中加入10ml 一抗封闭液（lOmllXTBS, 5p l吐温，5p l 一抗，0.5g奶粉），在脱色摇床上 摇lOmin,然后4C过夜孵育。取出膜后在IX TBS中漂洗2次。每次lOmin。 放入10ml二抗封闭液中。孵育2小时。取一片DAB溶于37C预热的10m超纯水。 用玻璃棒搅拌至完全溶解。加入20p l 30%的双氧水摇匀。倒入平皿中。将平 皿放于抽屉暗处显色5min。取出膜用灭菌去离子水漂洗终止反应，然后用清水 冲洗。1.8 蛋白质浓度的测定取可溶性蛋白质、亲和层析
13、样品 2、3 各 50ul 分别放于离心管中（两份）， 加灭菌超纯水稀释到500ul测定OD26o及OD280的分光光度值。1.9 酶活力测定取5只1.5mlEP管标号15,向1#管中加入1ml超纯水。2#加50l总蛋 白。3#管加50p 1分子筛峰处样，4#分别加入50p 1亲和层析3号样。5#中加 入11BAP和1ml灭菌处理过的超纯水（先加水，后加BAP标准品）。2#、3#、 4#管分别加超纯水稀释至 1m1。取5 只试管，洗净后标号 15 每个试管中加入 2ml 底物溶液，再把相应编 号的EP管中的溶液加入试管中。用力混匀。试管恒温37C水浴反应5min。在每 支试管中加入2501 1
14、M NaOH溶液终止反应。在可见分光光度计测量OD410计 算3 次平均值。计算酶活力。2 实验结果2.1 分子筛层析蛋白峰值图谱使用自动蛋白核酸分离层析仪连接纸机记录标准蛋白（牛血清蛋白（68kD）、 糜蛋白酶（25kD） 2:1混合液）及亲和层析的样品第2、3、4管混合样的出峰图 谱。标准蛋白分离情况不太好，主要是因为纸带没有固定好，有些不平整，走纸 也就走的不匀速，可能还有杂蛋白存在的影响；亲和层析混合样峰值较预期结果 偏低。2.2 SDS-PAGE 电泳鉴定亲和层析样品条带包涵体条带普通Maker条带总蛋白条带以普通 Marker 为对照对已经过处理的总蛋白、包涵体、亲和层析样品进行
15、SDS-PAGE 电泳分析。电泳结果显示，各样品特异性较好；目的蛋白处于第 8 和 第 9 条带之间，与普通 Marker 条带对比图对比可知，该目的蛋白的 kD 大概为 48，符合预期结果。2.3 Western-blot 鉴定以预染 Marker 为对照对已经过处理的总蛋白、包涵体、亲和层析样品进行Wes tern-blot分析。PVDF膜结果显示不是特别清晰，原因为转膜效果不够好， 可能是由于海绵或滤纸过大，导致PVDF膜短路；但仍能看到目的样品所处的条 带，其处于第5和第6条带之间（由于放置时间较久和转膜效果不理想，有些条 带不是很清晰），与预染 Marker 条带对比图对比可知，该目的蛋白的 kD 大概为 48，符合预期结果。2.4 酶活力计算及分析1、数据记录使用可见光分光光度计分别检测1#管-lml超纯水；2#-50卩l总蛋白+950卩l超纯水；3#-50p l亲和层析2号样+950l超纯水，4#-50l亲和层析3号 样+950l超纯水。5#-1p lBAP和1ml灭菌处理过的超纯水（先加水，后加BAP 标准品）,OD值。表一 样品 OD 值410次数 样品123平均值10.0000.0000.0000.00021.6541.6531.6531.65332.0952.094+2.0952.09543.0003.0003.0003.00052.1202.
