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1、人参皂苷Rg1对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用【摘要】目的讨论人参皂苷rg1对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用的影响。方法从孕16天sd大鼠胚胎脑组织中别离培养胚胎神经干细胞,免疫组化法进展神经干细胞的鉴定及增殖鉴定,采用稀释法挑选和检测人参皂苷rg1对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用的影响。结果剂量挑选结果显示,人参皂苷rg1组(100、4、0.8l/l)神经球数明显增加。选定人参皂苷rg140、4、0.4l/l作为高、中、低剂量进展进一步实验研究,与对照组相比,人参皂苷rg1高、中、低剂量组神经球生成数目明显增加。结论人参皂苷rg1可以明显增加神经球生成数目,具有促进胚胎神经干细胞体外增殖的作
2、用。【关键词】人参皂苷rg1;胚胎神经干细胞;增殖effetsfginsensiderg1ntheprliferatinfneuralsteellsulturedinvitrzhuzhi-huan,angxiu-yun,zhngpei-ru,etal(tianjinuniversityft,tianjin300193,hina)abstrat：bjetivetexplretheeffetfginsensiderg1nprliferatinfneuralsteells(nss)invitr.ethdsthenssultureseregeneratedfrthebrainfebryniday16s
3、drat.priitivenssereultured,prliferatedandpassaged.thenssereidentifiedbytheiunytheial(i)stainingfnestin.theistainingfbrduasadptedtharaterizetheprliferatinfnss.ardingtliiteddilutinethd,theeffetfginsensiderg1ntheprliferatinfnssasbserved.resultsthensseresuessfullyulturedandprliferatedinvitr.differentdsa
4、ges(100,4,8l/l)fginsensiderg1uldprtetheprliferatinfnssinvitr.parediththentrlgrup,thenubersfnerurspheresfthethreedsageginsensiderg1grups(40,4,0.4l/l)ereinreasedbviusly.nlusinsginsensiderg1signifiantlyprtetheprliferatinfnssinvitr.keyrds：ginsensiderg1;ebrynineuralsteells;prliferatin神经干细胞(neuralsteell,n
5、ss)具有自我更新才能和多向分化潜能1,在神经系统疾病或损伤的修复中起着重要的作用。研究调节nss增殖分化的影响因素,诱导其增殖和定向分化为中枢神经系统损伤修复和退行性变的治疗带来了希望。因此,nss的体外培养、增殖、诱导定向分化的研究已成为神经科学的一个研究热点。本研究对体外培养胎鼠nss进展增殖鉴定,观察了人参皂苷rg1对nss增殖才能的影响,为开发对nss具有保护效能的治疗药物、探究神经系统疾病新的治疗方法打下基矗1材料与方法1.1培养基、试剂及药物de/f12(11)培养基(lt.natb31223,hylne,u.s.a);hbss液(无钙离子和镁离子,lt.n01118197,ln
6、za,u.s.a);b27添加物(lt.n311624,gib/invitrgen);青霉素-链霉素溶液(双抗,100)(每毫升含有10000u青霉素以及10g链霉素,at.np4333,siga);重组人碱性成纤维细胞生长因子(bfgf,at.nyt-218,prspe-tany,israel);人表皮生长因子(egf)(lt.n3860501000,strathannbite,gerany);人参皂苷rg1、丹酚酸b(天津中一制药)。1.2大鼠胎鼠神经干细胞原代培养及传代取孕龄16天孕鼠,脱臼处死,75%乙醇浸泡消毒35in,无菌条件下翻开腹腔,取出串珠状子宫,浸泡于冷hbss液中。取出胎
7、鼠,置于另一含有冷hbss液的培养皿内,小心剥离外层骨膜,取出大脑皮质并去除软脑膜,冷hbss液漂洗2次后,转移至离心管。参加一定量冷hbss液后吹打至肉眼看不到明显组织块,使液体呈均匀悬浊状。过200目(70)筛网,1000r/in离心8in,弃上清,全培基(含2%b27、20g/lbfgf、20g/legf的de/f12,1%双抗)重悬,约34个胎鼠/752的密度种入培养瓶中,37、5%2培养箱中培养。每23d半量换液,搜集培养液到50l离心管中,静置35in,然后搜集上清(管底约留12l)转入另一离心管,500r/in离心3in。弃约一半上清液,补充入一样量的新颖的全培基(含1%双抗,2
8、%b27、20g/lbfgf、20g/legf的de/f12),重悬种置。约59d传代1次。500r/in离心3in,搜集培养的神经球,沉淀细胞用1l全培基重悬,用23号(内径0.65)注射器轻轻吹打5次,防止产生气泡,静置35in使未吹散的细胞沉底。搜集上清,管底的细胞再加1l继续吹打58次,搜集细胞补加全培基,以1105个/l的密度全培基重悬种入培养瓶或培养板。1.3神经干细胞及增殖鉴定采用ab法进展nestin免疫组化染色鉴定nss。染色步骤：盖玻片放入6孔板内,每孔加多聚赖氨酸处理60in;将细胞悬液接种于多聚赖氨酸处理过的盖玻片的6孔板内,贴壁生长2h;4%多聚甲醛固定20in;3%
9、h2237,30in;参加封闭血清,37孵育30in;甩去余液;滴加anti-nestin抗体(阴性对照不滴加一抗),4过夜;滴加生物素标记的二抗,37孵育30in;滴加ab复合物,室温孵育30in;滴加dab显色2in;50%甘油封片,显微镜下观察照相。用brdu标记nss进展增殖才能的鉴定。染色步骤：盖玻片放入6孔板内,每孔加多聚赖氨酸处理60in;将细胞悬液接种于含多聚赖氨酸处理过的盖玻片的6孔板内,贴壁生长2h;4%多聚甲醛固定20in;0.3%h2237,30in;2l/lhl,37变性30in;0.1l/l硼酸中和2次,每次10in;参加封闭血清,37孵育15in,甩去余液;滴加单
10、克隆anti-brdu抗体(阴性对照不滴加一抗),4过夜;滴加生物素标记的二抗,37孵育1h;滴加ab复合物,室温孵育30in;滴加dab显色2in;50%甘油封片,显微镜下观察照相。1.4稀释法挑选人参皂苷rg1对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用将nss克隆球制成1105个/l的细胞悬液,将该细胞悬液稀释240倍,参加不同剂量的中药(人参皂苷rg1)种入2个24孔板,每组4孔。第一板实验分组为：对照组、丹酚酸b组(0.035l/l)、人参皂苷rg1组(浓度分别为100、20、4、0.8l/l);第二板的实验分组为对照组、丹酚酸b组(0.035l/l)、人参皂苷rg1组(浓度分别为10、2、0.
11、4、0.08l/l)。常规培养4d后对神经球进展计数(包含细胞5)。1.5稀释法检测人参皂苷rg1对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用将nss克隆球制成1105个/l的细胞悬液,将该细胞悬液稀释240倍,参加不同剂量的中药(人参皂苷rg1)种入24孔板,共5组,每组4孔。实验分组为对照组、丹酚酸b组(0.035l/l)、人参皂苷rg1组(浓度分别为40、4、0.4l/l)。常规培养4d后对神经球进展计数(包含细胞5)。1.6统计学方法实验数据用xs表示,采用spss11.5统计软件作方差分析,进展组间比拟。2结果2.1神经干细胞培养鉴定及增殖鉴定对传代nss进展nestin染色,细胞胞浆呈棕黄色,
12、为阳性(细胞阴性对照那么不被黄染),说明本实验所培养细胞为nss。对传代nss进展brdu标记后染色,与brdu阴性对照比拟,nss细胞核被黄染,说明经传代后nss仍然具有体外分裂增殖才能。nss鉴定结果见图1。nestin普通染色(阳性)nestin普通染色(阴性对照)brdu普通染色(阳性)brdu普通染色(阴性对照)图1nss增殖鉴定2.2人参皂苷rg1对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用的剂量挑选(见表1、表2)与对照组相比,人参皂苷rg14l/l以及0.8l/l组神经球数明显增加,差异有统计学意义(p0.01);人参皂苷rg1100l/l组神经球数明显增加,差异有统计学意义(p0.05)
13、;其他剂量组神经球生成数目没有明显改变。通过实验结果分析,拟选定人参皂苷rg140、4、0.4l/l作为高、中、低剂量进展进一步实验研究,重复3次。表1人参皂苷rg1对神经球生成数目影响的剂量挑选(第一板)表2人参皂苷rg1对神经球生成数目影响的剂量挑选(第二板)2.3不同剂量人参皂苷rg1对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用的影响(见表3)表3不同剂量人参皂苷rg1对神经球生成数目的影响(xs)第1次实验结果显示,与对照组相比,人参皂苷rg1中、低剂量组神经球数生成数目明显增加,差异有统计学意义(p0.01)。第2次实验结果显示,与对照组相比,人参皂苷rg1高、中剂量组神经球生成数目明显增加,经
14、统计学分析,差异有统计学意义(p0.05),人参皂苷rg1低剂量组神经球生成数目明显增加,差异有统计学意义(p0.01)。第3次实验结果显示,与对照组相比,人参皂苷rg1高、中、低剂量组神经球生成数目明显增加,差异有统计学意义(p0.01)。3次实验结果综合分析说明,人参皂苷rg1可以明显增加神经球生成数目,具有促进胚胎神经干细胞体外增殖的作用,其中以低剂量(0.4l/l)作用更为显著(均p0.01)。3讨论nss具有在成体中枢神经系统中可分化为神经元的才能,改变了以往神经科学的固有观念,在临床和神经医学领域受到了普遍关注。ns培养体系的建立和完善,使ns增殖、分化以及迁移得以迅速开展。目前,
15、对nss的增殖研究国内外大局部集中于细胞因子对nss的影响,利用传统中药内源性诱导nss研究较少。中药的神经保护作用广泛且具有机制的多样性,因此,应用中药诱导nss的增殖,促进神经再生和神经功能的修复与重建,可望为中药治疗缺血性脑损伤开拓全新的治疗途径。人参是传统的补气中药,人参在许多神经系统疾病如阿尔茨海默并帕金森并周围神经损伤的治疗中,发挥着积极的作用2。人参皂苷rg1是人参活性成分中已提纯的单体成分,是人参中主要活性成分之一。人参皂苷rg1主要药理作用为改善微循环、进步组织抗缺氧才能,具有a2+拮抗作用、抗疲劳作用,改善学习记忆技能,促进dna、rna和蛋白质合成作用,对中枢神经有兴奋作
16、用。rg1因亦存在于三七当中,故其活血消瘀、改善循环、抑制血小板聚集的作用也很明显3。本研究选取补气健脑生药提取成分人参皂苷rg1,考察其对nss增殖的诱导作用机制。通过体外培养大鼠胚胎nss,免疫组化法进展nss的鉴定及增殖鉴定,说明本试验所培养细胞为nss,对传代nss进展brdu标记后染色,与brdu阴性对照比拟,nss细胞核被黄染,说明经传代后nss仍然具有体外分裂增殖才能。本研究证实了具有补气健脑作用的中药有效成分人参皂苷rg1可以作用于nss,对nss的增殖有明显的诱导促进作用。人参皂苷rg1高、中、低剂量均明显增加神经球的生成数目,以低剂量作用更为显著。说明临床可预期应用以补气为主的人
