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1、引言化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究必须执行药物非临床研究质量管理规范。试验设计应遵循随机、对照、重复的原则。化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究试验设计应结合毒性的发生机制、影响因素、临床意义和药物临床应用的适应症和给药方法等来考虑。动物种属的选择应依据拟采用的试验模型和观察的指标。动物的性别、年龄和生理状态应符合拟采用试验方法的要求。试验用药物应与用于人体的制剂一致。给药方式（包括剂量、途径和方案）应根据所采用的试验模型和拟定临床应用的情况来决定。观察部位应选择给药部位，同时考虑选择周围组织或可能暴露于受试药物的部位。如果其他非临床安全性研究（如长期毒性）的受试物与拟进行临床研究的制剂相同
2、或具有可比性，其研究结果可反映化学药物刺激性、过敏性和溶血性中的某一毒性，则可不进行相应的毒性研究。进行化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究时应尽可能明确受试物的成分（包括主药、辅料和杂质等的名称和量）。有相同给药途径上市制剂刺激性和/或过敏性和/或溶血性研究提示有一定毒性时，应与已上市制剂进行比较性研究，毒性应相当或更小。比较性研究的样本例数的确定应遵循统计学的基本原理。由于动物试验存在一定的局限性，因此进行化学药物刺激性、过敏性和溶血性评价时，应结合药学、药理、毒理及临床应用进行综合评价，明确药物是否能进行临床应用及临床应用时应关注的问题等。1化学药物刺激性刺激性是指非口服药物制剂给药后对给
3、药部位产生的可逆性炎症改变，若给药部位产生了不可逆性的组织损伤则称为腐蚀性。1.1化学药物(外用)刺激性试验的内容1.1.1试验动物首选家兔，动物数 4-8 只，雌、雄各半。应设赋形剂对照，采用同体左右侧自身对比法。试验前24 h对给药区（通常在背部）进行脱毛处理（可剪、剃或用适宜的脱毛剂）。去毛范围左、右各 3cm3cm。给药前应检查去毛皮肤是否因去毛而受损伤，有损伤的皮肤不宜进行试验。但若需考察破损皮肤的刺激性，则可在用药部位用砂纸磨或划“井”字并以渗血为度。1.1.2受试物的给予取受试物0.5 ml直接涂布于一侧已去毛的皮肤上，然后用二层纱布（2.5 cm2.5cm）和一层玻璃纸或类似物
4、覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定；另一侧涂布赋型剂做对照。贴敷时间至少4h。贴敷结束后，除去受试物并用温水或无刺激性溶剂清洁给药部位。多次给药皮肤刺激性试验应连续在同一部位给药，每次给药时间相同，贴敷期限一般不超过4w。1.1.3动物观察在自然光线或全光谱灯光下观察皮肤反应。参照表1给出的评分标准对皮肤红斑和水肿进行评分。表1皮肤刺激反应评分标准刺激反应分值红斑无红斑0轻度红斑（勉强可见）1中度红斑（明显可见）2重度红斑3紫红色红斑到轻度焦痂形成4水肿无水肿0轻度水肿（勉强可见）1中度水肿（明显隆起）2重度水肿（皮肤隆起 1mm，轮廓清楚）3严重水肿（皮肤隆起 1mm 以上并有扩大）4最高
5、总分值8表2皮肤刺激强度评价标准分值评价0-0.49无刺激性0.5-2.99轻度刺激性3.0-5.99中度刺激性6.0-8.0强刺激性单次给药皮肤刺激性试验，在去除药物后 30-60min，24、48 和72 h肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。如存在持久性损伤，有必要延长观察期限以评价上述变化的恢复情况和时间。但延长期一般不超过 14d。对出现中度及以上皮肤刺激性的动物应在观察期结束时对给药局部进行病理组织学检查。多次给药皮肤刺激性试验，在每次去除药物后 1h以及再次贴敷前观察及记录红斑及水肿、涂敷部位是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄情况及其发生时间及消退时间，并对红斑及
6、水肿进行评分。末次贴敷后，在去除药物后 30-60 min，24、48和72 h肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。如存在持久性损伤，有必要延长观察期限以评价上述变化的恢复情况和时间。但延长期一般不超过14d。对出现中度及以上皮肤刺激性的动物应在观察期结束时对给药局部进行病理组织学检查。1.1.4结果评价单次给药皮肤刺激性试验，计算每一观察时间点各组受试物及赋形剂皮肤反应积分的平均分值。将受试物皮肤反应积分的平均分值减去赋形剂皮肤反应积分的平均分值得到原发性刺激指数，按表2进行刺激强度评价。多次给药皮肤刺激性试验，首先计算每一观察时间点各组原发性刺激积分均值，然后计算观察期限内每天每只
7、动物刺激积分均值即累积刺激指数，按表2进行刺激强度评价。1.1.5试验意义观察动物皮肤接触受试物后所产生的刺激反应，提示药物临床应用后皮肤可能出现的炎症、组织变性和坏死等不良反应。该试验系统比人皮肤刺激反应敏感，刺激反应阴性大多可确定为无刺激性，阳性反应要排除假阳性。除非受试物有大范围或长时间的使用，否则轻度刺激性可不予重视。1.2注射用化学药物刺激性试验的内容1.2.1试验动物首选家兔，动物数每组不少于 3 只。应设生理盐水对照，可采用同体左右侧自身对比法。用药部位根据药物的给药途径确定，可选用耳缘静脉，耳中心动脉（其它动物可选用前、后肢静脉及股动脉等），股和背部肌肉，侧胸壁皮下组织，静脉旁
8、组织等。1.2.2给药方法按临床使用情况给予受试物，给药容积和速率应根据动物情况进行相应的调整。给药期限应根据药物拟用于临床的情况来决定，多次给药一般不超过 7 d。1.2.3动物观察单次给药刺激性试验，在给药后48-96 h对动物和注射部位进行肉眼观察；多次给药刺激性试验，每天给药前以及最后一次给药后 48-96 h对动物和注射部位进行肉眼观察。观察期结束时应对部分动物进行给药部位组织病理学检查。留下的动物根据受试物的特点和刺激性反应情况，继续观察14-21d再进行病理组织学检查，以了解刺激性反应的可逆程度。1.2.4试验意义根据肉眼观察和病理检查的结果，对受试物使用的安全性进行评价。观察动
9、物注射受试物后所产生的刺激性反应，提示药物临床应用后注射部位可能出现的炎症、组织变性和坏死等不良反应。1.3化学药物的眼刺激性试验内容1.3.1试验动物首选家兔，动物数每组不少于3只。应设置生理盐水对照组，可采用同体左右侧自身对比法。试验前 24h内对每只动物的双眼进行检查（包括使用荧光素钠检查）。有眼睛刺激症状、角膜缺陷和结膜损伤的动物不能用于试验。1.3.2给药方法每只眼睛滴入 0.1ml 或涂敷 0.1g 受试物，然后轻合眼睑约 10s。一般不需冲洗眼睛。用药周期应根据药物拟用于临床的情况来决定，多次给药一般不超过4w。1.3.3眼部观察单次给药眼刺激试验，在给药后 1、24、48 和
10、72h对眼部进行检查；多次给药眼刺激试验，每天给药前以及最后一次给药后 1、24、48 和 72 h对眼部进行检查。如果在 72 h未见任何刺激症状，试验则可结束。如存在持久性损伤，有必要延长观察期限，但一般不超过 21d。可使用放大镜、裂隙灯、生物显微镜和其他合适的器械进行眼刺激反应检查。在记录了 24h 的观察后，可进一步用荧光素染色检查。每次检查，都应记录眼部反应的分值（见表 3）。除了观察结膜、角膜和虹膜外，其他所观察到的损伤也应记录和报告。1.3.4结果评价按表3的要求，将每一个观察时间每一动物的眼角膜、虹膜和结膜的刺激反应分值相加得总积分，将一组的积分总和除以动物数，即得最后分值。
11、按表4判断其刺激程度。该试验系统比人眼睛刺激反应敏感，刺激反应阴性大多可确定为无刺激，阳性反应要排除假阳性。除非受试物有大范围或长时间的使用，否则轻度刺激性可不予重视。1.3.5试验意义观察动物经眼给予受试物后所产生的刺激性反应，提示药物临床应用后眼可能出现的炎症、组织变性和坏死等不良反应。表3眼刺激反应分值标准眼刺激反应分值角膜无混浊0散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见1半透明区易分辨，虹膜模糊不清2出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强可见3角膜不透明，虹膜无法辨认4虹膜正常0皱褶明显加深、充血、肿胀，角膜周围轻度充血，瞳孔对光仍有反应1出血/肉眼可见坏死/对光无反应（或其中一种）2结
12、膜充血（指睑结膜和球结膜）血管正常0血管充血呈鲜红色1血管充血呈深红色，血管不易分辨2弥漫性充血呈紫红色3水肿无水肿0轻微水肿（含眼睑）1明显水肿伴部分眼睑外翻2水肿至眼睑近半闭合3水肿至眼睑超过半闭合4分泌物无分泌物1少量分泌物2分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着3分泌物使整个眼区潮湿或粘着4最大总积分16表4眼刺激性评价标准分值评价0-3无刺激性4-8轻度刺激性9-12中度刺激性13-16强度刺激性1.4刺激性试验的目的及意义观察动物局部接触受试物后所产生的刺激反应，提示药物临床应用后给药部位可能出现的炎症反应、组织的变性和坏死等不良反应。药物的活性成分及其代谢物、辅料、有关物质及理化性质（如p
13、H值、渗透压等）均有可能引起刺激性的发生，而严重的毒性可以影响用药的安全有效性，因此药物在临床应用前应研究其制剂在给药部位使用后引起的局部和/或全身毒性，以提示临床应用时可能出现的毒性反应、毒性靶器官、安全范围、临床研究监测指标并为临床解毒或解救措施提供参考，保障临床用药的安全有效。2化学药物过敏性过敏性是指变态反应又称超敏反应，指机体受同一抗原再刺激后产生的一种表现为组织损伤或生理功能紊乱的特异性免疫反应，是异常或病理性免疫反应。其分类采用目前普遍接受的分类法：型又称快发或速发过敏型，由IgE介导，主要表现为荨麻疹、过敏性休克、支气管哮喘、变应性鼻炎、胃肠道与皮肤过敏反应等；型又称细胞毒型或
14、溶细胞型，由IgG介导，主要表现为库姆斯试验阳性的溶血性贫血，粒细胞减少和血小板减少性紫癜；型又称免疫复合物型或血管炎型，由IgG、IgM介导，主要表现为局限性肺炎、血管炎、狼疮样反应、肾小球肾炎等；型又称迟发型或结核菌素型，由T淋巴细胞介导，主要表现为接触性皮炎。光敏性包括光毒性（光刺激性）和光过敏性（光变态反应）两类，光毒性是由光诱导的非免疫性的皮肤对光的反应，药物可通过直接作用或通过血循环间接作用。光过敏性是获得性的免疫性介导的由光激活的皮肤对光的反应，系光感物质经皮吸收或通过循环到达皮肤后与吸收的光线在表皮细胞层发生的反应，为型变态反应的特殊类型。2.1化学药物过敏性试验内容2.1.1
15、被动皮肤过敏试验（PCA）内容试验的基本原理：将致敏动物的血清（内含丰富的IgE抗体）皮内注射于正常动物。IgE与皮肤肥大细胞的Fc3受体结合，使之被动致敏。当致敏抗原激发时，引起局部肥大细胞释放过敏介质，从而使局部血管的通透性增加，注入染料可渗出于皮丘，形成一个蓝斑。根据蓝斑范围或分光光度计法测定，判定过敏反应程度。2.1.1.1试验动物PCA 反应常用的动物是大鼠，亦用小鼠，有时根据试验需要用家兔。因这些动物 PCA 反应是由 IgE 介导的。2.1.1.2试验分组应设立阴性、阳性对照组和受试物不同剂量组。阴性对照组应给予同体积的溶媒，阳性对照组给予卵白蛋白或天花粉或已知致敏阳性药物。每组动物数至少4只。2.1.1.3致敏途径及方式应按临床拟给药途径。隔日致敏一次，共5次。末次致敏后10d左右采血，2000r/min离心10min，分离血清，-20保存，2w内备用。2.1.1.4激发上述各组抗血清一般用生理盐水稀释成 1：2、1：8、1：32。在动物背部预先脱毛 34cm2的皮内注射各
