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1、课题 2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、理论基础1筛选菌株（1）实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时或其他微生物生长。（2）选择培养基：在微生物学中，将允许种类的微生物生长，同时和其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。（3）配制选择培养基的依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养 微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养；的微生物加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。2统计菌落数目（1） 测定微生物数量的常用方法有和。（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当
2、样品的足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一 。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 的平板进 行计数。此外，测定微生物数量的常用方法还有直接计数。3设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中对实验结果的影响，提高实验结果白。例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需以培养的培养基作为空白对照。二、实验设计 关于土壤中某样品细菌的分离与计数实验操作步骤如下：1. 取样：从肥沃、湿润的土壤中取样。应 3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的中。2. 制备:准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基，将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋
3、白胨培养基上生长的菌落数目应明显 选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。3. 微生物的与观察将10g 土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中（体积为250 mL）,充分摇匀，吸取上清V ，转移至盛有的生理盐水的无菌大试管中，将土样以1、101、102依次等比稀释至107稀释度，并按照由107103稀释度的顺序分别吸取进行平板涂布操作。每个稀释度下需要3个选择培养基、1个牛肉膏蛋白胨培养基。将涂布好的培养皿放在30C温度下培养，及时观察和记录。挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含 培养基的斜面中，观察能否产生如教材中的颜色反应。4细菌的
4、计数当菌落数目稳定时，选取菌落数在的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。每克样品中的菌株数二。C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V:所用稀释液的体积；M:稀释倍数。三、鉴定1、尿素CO(NH2)2重要的农业氮肥。被土壤中细菌分解为nh3才能被植物吸收利用。细菌關酶C0(NH；)2 + H?0 C0；+2N比2. 、酚红鉴别培养基：鉴定分解尿素的细菌。原理：脲酶催化尿素分解成氨-培养基碱性增强-酚红变红-结论：该细菌能分解尿素。1、在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出相同而稳定的
5、菌落特征。2、关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。思维升华1分离尿素分解菌操作中的注意事项(1) 在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。(2) 样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有30300个菌落，细菌一般为104、105、106倍的稀释液，放线菌一 般为103、 104、 105倍的稀释液，真菌一般为102、 103、 104倍的稀释液。(3) 为排除非测试因素(培养基)的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。(4) 每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为实验重复，求其平均值，若其中有菌落数与其他实验差
6、距悬殊 的，需要对该平板重新制作。(5) 注意培养时间和温度，获取准确的菌落数。细菌：3037 C,培养12d；放线菌：2528 C,培养57 d； 霉菌(真菌)：一般在2528 C,培养34 do(6) 微生物的菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。仔细观察分离到的菌落，记录它们的特征。(7) 做好标记本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，最好在使用前就做好标记。(8) 规划时间对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊。2结果分析与评价内容绕果分析有无杂菌污染的判断对照的培养in中无菌落生长一未被杂菌污染培养基中菌落数偏高一被杂菌污染菌
7、落形态多样，菌落数偏高一培养物中混入基他杂菌逸择培养基的筛选作用半肉膏蛋白膵培养基的菌洛数目大于选择培养基的数 目一选择培养基具有筛选作用样品的稀释操作得到J个或卫个以上菌落数 目在30300的乎板一操作 成功重复组的结果若选取冋种土样，统计结果应接近一、研究思路1. 以下是分离土壤中分解尿素的细菌的培养基成分表，据表分析成分MgStl TTfcO葡萄糖尿素琼脂水含量1.4g2.1&D. 2g10. 0gL. Oglo. 0&适量(1) 表中的KH2PO4、NaHPO4和MgSO47H2O为细菌提供，葡萄糖为细菌提供 ，尿素为微生物提供。琼脂的作用。(2) 如果将利用蛋白质和多肽为唯一氮源的微
8、生物培养在该培养基上，能否长出相应的菌落？。能够在该培养基上生长繁殖的微生物只能。这种培养基被称做培养基。2. 三位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中细菌数量。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下统计结 果：甲同学涂布了一个平板，统计的菌落数是260；乙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是210、 240和250，取平均值233；丙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是21、 212和256，取平均值163；(1) 一个菌落就是一个细菌吗？ 。一个菌落可以代表样品中的一个活菌吗？ 。事实上，统计的菌落 数往往比活菌的实际数目低，原因 。(2) 在三位同学的统计中，只有一位同学的统计是正确的
9、，指出另两位同学的统计为什么不正确？。(3) 除了上述方法外还可以用显微镜直接测定微生物的数量，通过显微镜直接计数法得到的一定是活菌数吗？。要得到活菌数应该采取的措施。3在做本课题实验时，A同学从对应106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，而其他同学在同样的稀释度下 只选择出大约 50 个菌落。(1) 你认为出现A同学这种结果的原因可能是什么？。针对你提出的可能原因,设计对照实验，帮助A同学排除影响实验结果的因素。(2) 在探究实验中，实验设计要遵循等原则，即实验组和对照组只有 不同,其它条件都相同。这样可以排除任何其他可能原因的干扰，确保实验结果 引起的，从而提高实验结果的 。二、实验
10、设计以下是土壤中某样品细菌的分离与计数实验流程(1) 土壤取样前应对小铁铲和盛土的纸袋进行处理,取土样时要铲除表层土的原因 (2) 实验流程中，等操作都要在火焰旁进行。(3) 分离不同的微生物其稀释度相同吗？为什么？。但稀释的结果是相同的，即。测定土壤中分解尿素的细菌时，一般选用的稀释度是。(4) 涂布平板时，每个稀释度下需要涂布 个选择培养基和 个牛肉膏蛋白胨培养基,前者遵循了 原则，后者起 作用。计数时对培养基中的菌落数取其。(5) 某同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，他在三个培养基表面分别涂布稀释106倍的O.lmL菌液，经培养后得到的菌落数分别是222、212和241。那
11、么每克样品中的菌株数是。(6) 为进一步确定得到的是能够分解尿素的细菌，可以在选择培养基中加入 ，如果 ，我 们就可以准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。参考答案】预习案：一、1(1)目的菌珠 抑制 阻止 (2)特定 抑制 阻止 (3)自养 能固氮的微生物；2(1)有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。(2).稀释度 细菌 30-300 显微镜3. 非测试因素 可信度 无杂菌污染二、1. 土壤，铲去表层土。2. 培养基 多于 对照3. 培养 1ml 9ml 0.1mL 4.30-300 平均数重难探究：1、统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3 个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的
12、公 式进行计算2、这是因为土壤中各类微生物的数量(单位：株kg)是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌 氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不 同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。3、提供碳源的是 葡萄糖 ，提供氮源的的是 尿素4、 具有只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长 。5、第 二 位同学的结果接近真实值 改进的操作是第一位同学需设置重复实验组；第二位同学统计的三个菌落数 相差太大，说明操作有误，需重新实验。6、方案1：其他同学用A同学的土样进行实验。方案2： A同学以不接种的培养基作为空白对照。随堂练习14 ： CDCC
