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1、食品添加剂-安全天然食品防腐剂细菌素细菌素(bacteriocin)是某些细菌产生的具有抗菌活性的多肽、蛋白质或蛋白质复合物1，某些细菌通过核糖体机制产生的一类具有抑菌生物活性的蛋白质，大多数细菌素只对亲缘关系较近的细菌有毒害作用，产生菌对其产生的细菌素具自身免疫性。虽然细菌素是抵抗诸如单核细胞增生李斯特氏菌(L. monnocytogenes)等食品病原菌的抑菌剂，它们并不同于青霉素等抗生素；传统的多肽抗生素是由细胞多酶复合体催化形成的，不存在结构基因2，而细菌素由基因编码,可以通过基因工程的手加以改造。它们的合成及作用模式与临床使用的抗生素亦不同。此外，对抗生素显示抗性的微生物通常不对细菌
2、素显示交叉抗性，且与抗生素的抗性不一样，细菌素抗性通常不是由遗传决定的。虽然尼生素是商业上使 用 的 唯 一 的 纯 化 的 细 菌 素 ， 别 的 如 小 球 菌 素(pediocin)，已经在食品中应用。由于食品安全问题正越来越受到国际社会的关注，来源于乳酸菌的能抵抗食品病原菌且无毒性或其它不利影响的抗菌肽的应用已经引 起 很 大 的 关 注 。美 国 每 年 花 在 与 空 肠 弯 曲 菌(Campylobact er jejuni ) 、韦氏梭菌(Clost ridiumperfringens)、 大肠杆菌(Escherichia coli O157:H7)、单核细胞增生李斯特氏菌(L
3、isteria monocytogenes)、 沙门氏菌(Salmonella)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等有关的食品引发的疾病的费用在 6.534.9亿美元之间3。随着对含有化学防腐剂的食品消费的增多，消费者对食品安全更加关注，出现了对更“天然 或“尽量少的加工”食品更大的需求。因此，人们对天然的防腐剂细菌素产生了浓厚的兴趣。文章以尼生素为重点对细菌素与抗生素的区别、活性细菌素分子的形成以及其在食品中的应用进行了较详细的讨论，比较了这两种类型的分子的合成、作用模式及抵抗力和安全性。1 细菌素的来源及分类为了维持自身的生存或其生态小环境，许多真核生物形成了对
4、抗竞争者或传染者的抗菌防御系统4。从许多种类的真核生物中均发现，抗菌肽的产生是其第一层防御，也是其先天免疫性的一部分。有时这些多肽对特定的竞争菌群起作用，有时它们的广谱活性可作为更一般的防御机制。抗菌肽通过不同的机制保护寄主，但最常见的是通过增加靶细胞膜的通透性，导致胞内物质的不可逆泄漏及随后的细胞死亡。来源于真核细胞的抗菌肽具有不同程度的毒性。例如，防御素(defensins)，由人类的嗜中性粒细胞产生，在高浓度时对生产其的细胞有细胞毒素的作用。虽然从真核细胞中分离出了许多种类的抗菌肽，但它们的细胞毒素限制了其在食品中使用。细菌素最先发现于 G菌中。大肠杆菌素由多种抗细菌蛋白组成，它们可以通
5、过各种机制：比如抑制细胞璧的合成，增加靶细胞膜的通透性，或抑制 RNA 或DNA 的活性，杀死亲缘关系较近的细菌5。在 G+ 细菌中，乳酸菌已经成为抗菌肽的巨大来源库。如前所述，由细菌产生的抗菌蛋白或多肽称为细菌素(bacteriocins)。它们是核糖体合成的，能杀死亲缘关系较近的细菌。由于细菌素是从诸如肉及膳食产品等食品(通常都含有乳酸菌)中分离得到的，它们已经被人们不自觉地消费了数世纪。一个对乳酸细菌的40种野生型菌株的研究表明其中的35 种产生尼生素6。有超过40 个的国家允许使用尼生素，并且已经作为食品防腐剂使用。人们常将细菌素与抗生素混淆。从法制的角度来说这将限制它们在食品中的应用
6、，因为包括我国在内的因为许多国家禁止抗生素应用于食品中。所以有必要正确区分细菌素与抗生素。它们的主要区别见表1，细菌素可明显地区别于临床抗生素，可以安全及有效地使用以达到控制食品中目标病原体生长的目的。在此以合成作用模式、抗菌谱、毒性及抵抗机制为基础来区别细菌素与抗生素。通常将细菌素分为三或四种类型7。第一类(class1)细菌素称为羊毛硫抗生素( lantibiotics)。通常第一类细菌素典型地具有1950 多个氨基酸不等。第一类细菌素以它们的稀有氨基酸为其主要特征，如羊毛硫氨酸(ALA-S-ALA)， - 甲基羊毛硫氨酸(ALA-S-ABA)，脱氢丙氨酸(DHA)和脱氢丁氨酸(HBD)。
7、第一类又可再分为class 1a 和class 1b。class 1a 细菌素，包括发现于 1928 年的尼生素(nisin)，由阳离子及疏水性多肽组成，可以在靶细胞膜上形成孔道，还含有柔性的结构，而class 1b 类的多肽含有比较刚性的结构。发现于 1948 年的枯草菌素(subtilin)是一种尼生素的类似物，在12 位氨基酸残基上与尼生素不同，亦属于此类。class 1b 细菌素，属于球型多肽。第二类(class II)细菌素指那些细菌生产的小的热稳定的不经修饰的多肽，可以进一步划分。class IIa 包括小球菌素状的李斯特氏活性多肽，具有保守的N端序列 Tyr-Gly-Asn-Gl
8、y-Val 及在多肽N端半部有两个半胱氨酸形成的双硫桥键。class IIb 包括由两个不同的多肽组成的细菌素，对其活性来说两个多肽都是必需的。这些多肽的主要氨基酸系列是不同的。那些大的、热不稳定的细菌素组成第三类(class III)。第四类由能够与其它大分子形成大复合物的细菌素组成，其带正电荷及疏水性的特点致使之与粗提物中的其它大分子形成复合物。然而，到目前为止，对第一、第二类细菌素了解得较多，并且是最有可能在食品中应用的，文章将重点讨论这两类细菌素。2 活性细菌素及抑菌特性2.1 细菌素的合成细菌素是在核糖体中合成的。产生活性细菌素的因通常在操纵子簇。研究得较多的是含有产 lantibi
9、otic基因的操纵子。许多含产lantibiotic 基因的操纵子属于class 1a。属于 class 1b 的 mersadicin 的全部基因簇最近也已被阐明。基因编码生产细菌素可以位于染色体，也可以在质粒或转位子中编码。许多nonlantibiotics，比plantaricin、pediocin 及 sakacin 等的遗传规律已经被阐明。而类似情况存在于 lantibiotic 基因(结构、转运、调整基因等)，plantaricin 系统的基因也编码若干细菌素，这些细菌素共用转运及调整基因系统8。与细菌素不同，抗生素通常被认为是次生代谢产物，它不是由核糖体合成的。虽然有些抗生素如万
10、古霉素也是由氨基酸组成的，但它们是由酶合成的。实际上，较多抗生素是通过一种多载体含硫模板机制(amultiple-carrierhiotemplate mechanism)合成的，在那里多肽合成酶装配氨基酸以形成抗生素分子9。因为细菌素是由一个结构基因编码的，使得活性位点以及结构 - 功能的关系可以简单地通过基因工程加以测定。而不象抗生素那样，需通过化学方法合成或因其基因工程的复杂性致使涉及更多的基因。2.2 转译后修饰形成活性细菌素分子虽然细菌素由核糖体合成，必需经过转录后修饰才具有活性。编码修饰促酶的基因通常与结构基因紧连。Lantibiotics 经过最广泛的修饰。LanB 是一种跨膜蛋
11、白质，由lantibiotic 生产者转录，且在运出细胞之前经酶修饰。LanC 则参与 lantibiotics 中硫醚键的形成 。Lantibiotics 合成的一个特点是存在一个 N 端前导多肽( l ead er pept i de) ，接着它的是一个 C 端多肽前体(propeptide)。前导多肽(leader peptide)最初被认为是作为在转录之后修饰涉及的酶的识别位点。使用未经修饰的多肽前体(propeptide)的实验表明它们(多肽前体)也能够被识别及修饰。Lantibiotics 在转录之后的广泛修饰包括若干稀有氨基酸的形成。在 lantibiotics 中发现12 种以
12、上的稀有氨基酸 ，Nonlantibiotics 的多肽前体(propeptide)也通过前导系列的删除而被修饰8。这些修饰对于细菌素的分泌及横跨细胞膜的迁移是必要的。2.3 细菌素的免疫性细菌素与抗生素的区别在于生产细菌素的细胞对其产物(细菌素)具有免疫力。细菌素中编码免疫蛋白的基因靠近其结构及调整基因。通常细菌素的结构与免疫基因位于同一个操纵子且是紧连的1 。最初认Lantibiotics 的免疫性只与一种免疫基因有关，对尼生素是nis1 而对枯草菌素则是 Spa1，它们分别编码 nis1 及Spal 免疫蛋白。然而，似乎这些细菌素的免疫性是几种蛋白质影响的结果，因为删除可以编码其它蛋白质
13、的基因将改变寄主的免疫性12。例如，不产尼生素的对尼生素有抗性的菌株Lac.lactis并不具有编码Nis1免疫蛋白的基因单元，但含有类似于nisF、nisE 及nisG 的基因序列，而这被认为是此菌株对尼生素有抗性的原因。删除 n is G 使得细胞对尼生素的抗性减小。对于第二类class 11)细菌素 nonlantibiotics，免疫现象要简单些。它们具有一种可以编码免疫蛋白的基因。通常，此免疫蛋白是松散地与膜结合在一起的具有50150氨基酸残基的碱性蛋白。乳球菌素A(Lactococcin A)免疫蛋白(Lcn1)是目前为止研究得最多的。2.4 抑菌性及其影响因素研究得较多的是尼生素
14、的抑菌性。尼生素主要抑制大部分G+ 菌的生长，包括产芽孢杆菌(如肉毒杆菌)、耐热腐败菌(如嗜热脂肪芽孢杆菌)等。它在食品防腐中的重要价值在于能抑制芽孢细菌(包括嗜热产气芽孢菌)。由于多数 G+ 菌能引起食品腐败，有些并能导致食物中毒等危害人健康，因此尼生素作为食品防腐剂是重要的、有效的。早期的研究认为，尼生素一般对霉菌、酵母菌和G菌无效。但近期的研究表明，在一定条件下(如冷冻、加热、降低pH 和 EDTA 处理)，一些G 菌如沙门氏菌、大肠杆菌、假单胞菌、拟杆菌、放线杆菌、克雷伯氏菌，对尼生素敏感。例如，尼生素的溶解性在 pH2 时比pH8 时要高228 倍。在酸性条件下，尼生素对温度较稳定，
15、随着 pH 值的增加，温度越高，尼生素活性下降越显著，pH6 和7 时，121、20min 高温后尼生素活性完全丧失。同时，放置温度和时间对尼生素活性也有显著影响，放置温度越高、时间越长，尼生素活性下降越显著 。此外，食品的化学成分和物理状态对细菌素的活性有巨大的影响。细菌素，特别是lantibiotics，是通过在膜上形成孔，耗尽跨膜电势差()和 pH 梯度，导致细胞物质的泄漏而抑制靶细胞。细菌素是带疏水片段的正电荷分子，其与靶细胞膜上的带负电荷的磷酸盐基团的静电相互作用被认为有助于其最初的与靶细胞膜的结合。最近的研究表明尼生素活性的复杂性在于，为了杀死细胞必需与细胞膜上的脂质 II 结合1
16、5。可以推测为了接近诸DNA、RNA、酶及其它位点等靶以杀死靶细胞，细菌素必需首先进入细胞。现在已经证明有一种第二类细菌素可以精确地抑制敏感细菌中的细胞质膜的形成。细菌素对不同靶细胞的作用并不相等，研究者测定了细菌素对特定的菌种及菌株的亲合力，目标菌株的磷脂成分及环境的 pH 值影响 MIC 值16。最近有研究表明，似乎在靶细胞膜上的入坞分子(docking molecules)更有利于与细菌素作用并增强细菌素的抑制效果。其它细菌素也可以作用于靶细胞膜的特定位点，这些位点可质。而这些相互作用可以提高细菌素的抑制活性。蛋白质 PAI 及乳球菌素A 都能形成不依赖于电势的孔。乳球菌素能透过敏感细胞囊而其脂质并不受影响。这表明一个细胞表面的类似受体的实体是必需的(如脂质II )15,16。 2.5 细菌素的毒性细菌素作为乳酸菌(LAB)的产品已经被人们消
