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1、iPS细胞定向分化为胰岛p细胞0研究小组成员：刘楠，李辉莹，吴德伟，窦坤，蒋韬，周溦，陈珺，曾扬，杨杨，李磊，吴 尚宜，朱翔龙指导教师：高绍荣博士Abstract:iPS cells are somatic cell derived pluripotent cells induced by four factors. These cells can give rise to derivatives of all three germ layers. iPS cells have the potential to be differentiated into cell types such as
2、 neurons and blood precursors, which has broad implications for the use of stem cells for potential use in therapy. In this project we want to induce iPS cells instead of ES cells to induce pancreatic 卩 cells for transplantation therapy of type I diabetes mellitus which is caused by an autoimmune de
3、struction of the insulin-producing卩 cells.A. Introduction to iPS cells and Pancreatic p cellsWhat are iPS cells?iPS 细胞(induced pluripotent stem cells)这一名词由 Yamanaka在 2006 年提出。他的小 组通过对胚胎干细胞的研究发现，胚胎干细胞中存在一系列特异性表达的蛋白质，而当胚胎 干细胞分化时，这些蛋白表达减少。那么如果在小鼠体细胞内表达这些蛋白，能否使体细胞 转变为具有干细胞全能性质的细胞呢？经过对这些因子的组合和筛选，他们确定了 Oc
4、t4， Sox2，c-Myc 和 Klf4 这四种转录因子。他们使用慢病毒载体将这四种因子(及其各自的启 动子)导入到小鼠皮肤成纤维细胞中，并经过筛选，发现了具有干细胞形态的细胞群落。这 些细胞群落具有胚胎干细胞特异的表面抗原(Stage specific embryonic antigen , SSEA),也 通过 Teratoma formation、Chimera formation 和 Tetraploid complementatio n 检测(参考 method)，Qunrent Opsrucin in OmelFcg S Oevelopmenit 充分证明了它们具有多能性(plu
5、ripotent),因此命名为induced Pluripotent Stem cells。1 2007 年 12 月，日本的 Yamanaka 和美国威斯康辛大学的 Thomson 小组分别在 cell 和 science 上同时发表自己的研究成果 1,2，他们成功地将人的成纤维细胞重编程，诱导成为了 多能干细胞。与小鼠中的方法相同，他们将四种因子转入体细胞中。两个小组导入的因子有 两个是相同的(Oct4, Sox2), Yamanaka小组的另两个因子是c-myc和klf4，而Thomson 的是nanog和lin28。Oct4，Sox2被证明是维持干细胞状态所必需的因子，而另外两个因子
6、更多起到的是促进转化和抑制凋亡的作用。这两套因子具有各自的优缺点。事实上除了 Oct4外，其他因子多可被其家族中的同源 蛋白取代。 3Fig. 1体细胞(Fibroblast)加入四种因子以后，重编程为iPS细胞。iPS细胞具有分化为三个胚层细 胞的能力，已经证明可以分化为血细胞和神经细胞。 Taken from Laurie A Boyer ， Current Opinion in Genetics&Development3Why iPS?iPS细胞与胚胎干细 胞相比有很多优点。一是来源。胚胎干细 胞 (embryonic stem cells， ESCs)是指当受精卵分裂 发育成囊胚时内细
7、胞团Fig. 2 Embryonic stem cells are derived from inner cell mass of theBlastocyst. Taken from Pesce and Scholer, 1998(Inner Cell Mass)的细 胞，如图2。取得胚胎干细胞必须破坏胚胎。因此对人胚胎干细胞的研究一直阻力重重。而 iPS 细胞则由体细胞诱导产生，不存在类似的问题。二是用于治疗时，异源的胚胎干细胞治疗会引起免疫排斥反应oiPS细胞取自病人组织， 产生的是病人特异的干细胞，避免了上述问题。当然iPS细胞现阶段也存在缺点。在Yamanaka小组使用的因子中，c-m
8、yc是原癌基因， 小鼠iPS实验证明此基因的失控会导致癌症的发生。而除此之外，iPS小鼠存在明显的健康 问题，死亡率很高。Yamanaka小组已经通过去除c-myc因子进行了研究，在小鼠和人实验 中得到了很好的结果。4另外，慢病毒载体的使用也会导致基因组的整合，诱发危险。总之，iPS在研究和应用上都面临着很多的挑战，解决这些问题将促进iPS细胞在临床 治疗中的研究及应用。Differentiation of iPS cells to pancreatic B cells已经有研究将iPS用于治疗镰刀型贫血症的研究，并在小鼠体内取得了成功5。我们小 组着眼于iPS细胞向胰岛卩细胞的分化。通过利用
9、体细胞诱导产生iPS细胞，然后将iPS细 胞诱导分化为胰岛卩细胞，以用于I型糖尿病的治疗研究。I型糖尿病是由产生胰岛素的卩细胞的自身免疫破坏而引起的胰岛素缺乏的疾病。现有 的治疗方法并不能治愈糖尿病并且无法防止一些并发症的产生。通过细胞移植来治疗早期病 人和使卩细胞恢复其功能无疑是一个比较理想的方法，可以不依赖于胰岛素并且防止并发症 的发生。但是移植的缺陷在于供体组织的缺乏。当前的研究已经表明人胚胎干细胞（hESC）能够自然地分化为胰岛素生成细胞，能够 分泌胰岛素并表达特异标记。在小鼠中由胚胎干细胞诱导的卩细胞移植已经已经能够成功治 疗糖尿病（链脲菌素制作的小鼠模型）6。随之的研究又进一步将h
10、ES细胞诱导为类似于未 成熟的胰岛卩细胞的胰岛样细胞簇，提高了胰岛卩细胞的产量。这些研究都为I型糖尿病的 治疗打下了基础。 7来自Yan Shi等人的研究将诱导的过程简化8，提出用actin A和RA联合其他的一些胰 岛成熟因子来诱导ES成为胰岛素生成细胞并获得成功。actin A为TGF-卩超家族的一员， 能够促进最后的内胚层分化，在原肠形成中对内胚层和中胚层的形成起重要作用。RA （视 黄酸）在脊椎动物的神经外胚层前后轴形成中是一种很好的特征信号分子，并且有研究表明 RA也参与胚胎内胚层分化的调节尤其是胰岛芽基的形成，同时能够提高胰岛卩细胞中胰岛 素的生成。将actin A和RA结合能够促
11、使xenopus （爪蟾）囊胚中假定的内胚层区域分化为 胰岛素阳性细胞。以往胰岛卩细胞的产生是利用胚胎干细胞进行的，我们希望通过iPS也可以分化得到的 胰岛卩细胞用于治疗，已解决胚胎干细胞来源的问题。B. MethodProduce iPS cells实验的原理：把老鼠的一种皮肤细胞“纤维原细胞”进行逐渐分离，最后得出新的细胞形态。使用一种 滤过性病毒载体，将四种转录子的基因副本，即Oct4, Sox2, c-Myc，和Klf4导入正常小 鼠细胞内。因为重组率只有千分之一，因此需要剔除无用的细胞。被选出的重组细胞被称为 多能性引诱干细胞GPS）。在新的研究中，把小鼠中得到的重要发现转移到人体。
12、选择来自 不同人供体的成人皮肤成纤维细胞和另外两种人成纤维细胞群（来自润滑组织和新生儿包 皮），作为重新编程靶细胞。然后用携带人Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc转基因的逆转录病毒载 体转导人成纤维细胞培养物，之后在人ES细胞培养条件下培养细胞。转导30天之后，类 似人 ES 细胞的 iPS 克隆（在其他克隆之间）覆盖了培养皿，并可进一步扩增和扩大。在人 iPS 形成之后，逆转录病毒载体使4 个转基因沉默（与在小鼠系统中的发现一样），这说明 iPS 细胞完全重新编程，不再依赖于转基因的表达。（A）Time schedule of iPS cell generation.9AReiro
13、viral ReseedingColonyon feederpic king up10% FBS巨g medium + bFQF成纤维细胞诱导为iPS的实验操作步骤：1、成纤维细胞的来源与培养来源：成人皮肤成纤维细胞（HDF）培养：用含10%小牛血清（FBS）和0.5%青霉素与链霉素的DMEM培养基（Dulbeccos modified eagle medium） 37 C 培养2、载体构建Oct3/4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 经 RT-PCR扩增后构入载体 pMXs。3、载体转染PLAT-E packaging细胞在转染试剂Fugene 6存在的情况下，用pMXs载体转染PLAT
14、-E packaging细胞24小时。（Plat-E 细胞系：为暂时包装逆转录病毒的一种有效而稳定的系统）4、转染 HDF用含有四种逆转录病毒的培养液上清转染HDF细胞,然后培养于含10%小牛血清（FBS） 和0.5%青霉素与链霉素的DMEM培养基。5、iPS 细胞的产生转染六天后，用胰蛋白酶处理并转移至用丝裂霉素处理过的SNL feeder cell DMEM培 养基中。一天后，用含有4ng/ml bFGF（basic fibroblast growth factor）的ES细胞培养基。此后， 每两天更换一次培养基。转染后的第30天，根据细胞形态挑出iPS细胞。将其用PBS清洗 并经胰蛋白酶
15、/EDTA处理后接种至新鲜ES细胞培养基继续传代培养，或-80C冷冻保藏备 用。（SNL细胞系：是在STO饲养层细胞中转mLIF基因和neoY基因的饲养层细胞株，它能 分泌mLIF因子抑制ES的分化。体外培养条件基本同MEF饲养层，但需加L-谷氨酰胺。）(B) Morphology of HDF.(C) Typical image of non-ES cell-like colony.(D) Typical image of hES cell-like colony.(E) Morphology of established iPS cell line at passage number 6.
16、(F) Image of iPS cells with high magnication.(G) Spontaneously differentiated cells in the center part of human iPS cell colonies.目前 iPS 的安全性问题还没有完全解决。植入细胞内染色体位点上的4 个新的基因，有 可能阻断某些正常基因的功能；并且这 4 个基因有可能都是癌基因，存在诱发机体产生肿瘤 的可能。Confirm pluripotence以下常规实验被用来检测实验中产生的iPS细胞的多能性。1. Specific gene expression干细胞中存在几个特异表达的蛋白：SSEA (Stage specific embryonic a
