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1、高效液相色谱法测定旱莲草中木犀草素和芹菜素的含量 09-09-03 09:52:00 编辑： studa20作者：杨海英王雪梅杜刚 王建平 李光军 高云涛【摘要】 目的建立了同时测定旱莲草中木犀草素和芹菜素含量的高效液相色谱（ HPLC）法。方法采用 Shim-pack CLC-ODS色谱柱（ 150 mm6 mm， 5 m），流动相为乙腈 -2%的醋酸水溶液 ( 体积比为 30 70), 流速 1.0 ml min-1, 检测波长 340 nm, 柱温为 40。结果在上述条件下，木犀草素和芹菜素的质量浓度分别在 0.003 0.24 mg ml-1 和 0.002 5 0.20 mg ml
2、-1 时与色谱峰面积之间的线性关系良好，两者的平均加标回收率分别为 100.6%和 102.5%。结论该方法快速、简便、准确，可用于旱莲草中木犀草素和芹菜素的 HPLC测定。【关键词】旱莲草 ;木犀草素 ;芹菜素 ;高效液相色谱法Abstract ： ObjectiveTo establish an HPLC method for content determination of luteolin and apigenin in Herba Ecliptae. MethodsHPLCseparation was carried out in a Shim-pack CLC-ODS columm
3、 (150 mm6mm，5m) with acetonitrile -2% acetic acid (3070, v/v) as mobilephase at a flow rate of 1.0 mlmin-1. The detection wavelength was340 nm and the column temperature was maintained at 40.ResultsThere were good linear relationships between the massconcentrations and the peak areas of luteolin and
4、 apigenin in theranges of 0.0030.24 mg ml 1 and 0.0025 0.20 mg ml 1,respectively. The recovery rates were 100.6% and 102.5%,respectively.ConclusionThis method is rapid, accurate andreproducible for determination of luteolin and apigenin in HerbaEcliptae.Key words ：Herba Ecliptae;Luteolin;Apigenin;HP
5、LC旱莲草 (Herba Ecliptae)别名墨旱莲、金陵草、莲子草、旱莲子，为菊科鳢肠属植物的全草 , 主产于江苏、浙江、江西、湖北等地，资源丰富。中医用其滋补肝肾 , 凉血止血 , 乌须发等 1。旱莲草的化学成分主要有三萜皂苷、噻吩类、香豆草醚类、黄酮类化合物等 2。报道研究表明旱莲草中的黄酮类成分具有免疫调节作用和明显的抗自由基及体内抗氧化功能 3，4，近年来以木犀草素和芹菜素为代表的天然黄酮的药理药效作用也受到日益广泛的关注 5， 6。王自军等 7用紫外 - 可见分光光度法测定旱莲草中总黄酮含量 , 刘翔等 8报道用 HPLC法检测旱莲草中的木犀草素含量。为了更准确地反映旱莲草药材中
6、黄酮苷元的含量，本实验建立了 HPLC法同时检测旱莲草药材中的木犀草素和芹菜素含量。结果表明，该方法简便、准确可靠，为更好地开发利用旱莲草药材资源提供了理论依据。1 仪器与试剂日本岛津 SPD-10AT高效液相色谱仪 (LC-10ATvp 泵， SPD-10Avp检测器， SIL-10AP 自动进样器， CTO-10ASVP柱温箱， CBM-20A控制器 ) ；超纯水器 (arium 611UF,Sartorius) ；超声波清洗器 (AS3120A，天津瑞森特 ) ；电子天平 (AdventurerTM ， AR2140，上海奥豪斯公司 ) ； 旋转蒸发仪 (R-200, 瑞士 Buchi)
7、 。乙腈为色谱纯；实验用水为超纯水，蒸馏水自制，其它试剂均为国产分析纯试剂。木犀草素和芹菜素对照品购自成都欧康植化科技有限公司（纯度98%）。旱莲草药材购自云南省西双版纳药材公司 ( 经云南中医学院杨礼攀副教授鉴定为正品 ) 。2 方法和结果2.1色谱条件色谱柱： Shim-pack CLC-ODS柱（ 150 mm6 mm，5m），流动相：乙腈 -2%的醋酸水溶液（ 3070），流速： 1 ml min -1 ，检测波长： 340 nm，柱温： 40，进样量： 20 l 。2.2对照品溶液的制备分别称取经40减压干燥至恒重的木犀草素和芹菜素对照品适量，精密称定，甲醇溶解，制成每毫升含木犀草素
8、 0.48 mg ，芹菜素 0.40 mg 的对照品混合溶液，置于 4的冰箱中保存。 取对照品混合溶液适量，加甲醇制成含木犀草素0.003 ，0.006 ，0.030 ，0.12 ，0.24 mg ml -1 ，芹菜素 0.0025 ，0.005 ，0.025 ， 0.10 ，0.20 mg ml -1 的系列对照品混合溶液。2.3 供试品溶液的制备取干燥旱莲草药材粉末 ( 过 80 目筛 ) 约 2.0 g, 精密称定，置于圆底烧瓶中 , 加入 25 ml 石油醚加热回流浸提 1 h, 过滤后药渣用 40 ml 85% 的乙醇提取两次，每次加热回流提取 2 h ，过滤，合并提取液，向提取液中
9、加入 0.6 ml 浓盐酸，在水浴 80下水解 1 h 。冷却，用 5.0 mol L-1 的氢氧化钠溶液调至 pH 约中性。用旋转蒸发仪浓缩近干，将浓缩液转移至 10ml 容量瓶中 ,用甲醇定容，摇匀，经0.45 m滤膜过滤，即得。色谱图见图1。2.4线性关系分别精密吸取“2.2 ”项中系列对照品混合溶液20 l ，按照上述色谱条件测定，以峰面积（Y）为纵坐标，浓度（ X）为横坐标，绘制标准曲线，得标准曲线回归方程。木犀草素：Y=1E+07X-4 411.8 ， r=0.9997，线性范围： 0.003 0.24 mg ml 1；芹菜素： Y=2E+07X 24 144 ， r=0.999
10、5 ，线性范围： 0.002 5 0.20 mg ml 1。 09-09-03 09:52:00 编辑： studa202.5精密度实验取含木犀草素0.12 mg ml 1，芹菜素 0.10mgml-1 的对照品混合溶液（“ 2.2 ”项下制备），连续进样RSD=1.92%,芹菜素 RSD=2.16%，表明仪器的精密度良好。5 次，木犀草素图1HPLC图（略）2.6稳定性实验样品试液（“2.3 ”项方法配制）放置 0，2，4，18，24h，分别按“ 2.1 ”项色谱条件测定，测得木犀草素的峰面积RSD为 1.80%，芹菜素的峰面积 RSD为 0.92%，表明样品放置 24 h 稳定。2.7回收
11、率实验称取已知含量的旱莲草药材粉末5 份，每份 1.0 g, 精密称定，精密加入每毫升含木犀草素1 mg, 芹菜素 0.1 mg 的混合对照品溶液 1ml，按“ 2.3 ”项方法进行样品处理，在上述色谱条件下进行分析测定，计算木犀草素和芹菜素的回收率，结果分别为100.6%，102.5%，RSD分别为 2.01%，3.10% （ n=5）。2.8样品的测定按 “2.3 ”项方法制备的样品溶液，采用上述色谱条件进行分离，经测定，旱莲草药材样品中木犀草素的含量为0.791 mg g-1 ，芹菜素的含量为 0.064 1 mg g-1 （ n=3）。（ mgg-1 即 1 mg 黄酮苷元相当于1g
12、药材）。3 讨论3.1 检测波长的选择据文献报道 9 木犀草素和芹菜素在 340360 nm之间有较大吸收峰 , 木犀草素的最大吸收波长为 350 nm，芹菜素在 340 nm 处吸收峰达最大 , 考虑到样品中芹菜素含量很低 , 最后选定 340 nm 作为检测波长。3.2 提取溶剂的选择本文分别考察了水、乙醇 - 水（ 8515）混合溶剂作为提取溶剂对提取效果的影响。结果显示采用水作为提取溶剂时，色谱图中未检测到芹菜素峰，且木犀草素含量相对较低。因此选择乙醇 - 水（ 8515）混合溶剂作为提取溶剂。3.3水解条件的确定为了准确测量旱莲草中木犀草素和芹菜素的含量们考察了盐酸浓度和水解时间对提
13、取样品中所含黄酮苷元含量的影响。在上述, 我提取条件下 , 考察盐酸浓度为 0.08 ，0.16 ，0.24 ，0.32 mol L-1 对黄酮苷元含量的影响，结果当盐酸为 0.24 mol L-1 时，测得的黄酮苷元含量最高。然后考察了提取液在 0.24 mol L-1 盐酸中水解 0.5 ， 1， 2 h 对黄酮苷元含量的影响，结果水解 1 h 以上 , 黄酮苷水解基本完全。实验结果表明，最佳水解条件是提取液在 0.24 mol L-1 盐酸中水解 1 h 。3.4 提取物中木犀草素和芹菜素的存在形式黄酮类化合物在植物中大多以糖苷的形式存在 10， 11, 为考察提取物中木犀草素和芹菜素的
14、存在形式，本文对以下提取方法和“ 2.3 ”项提取法所得样品溶液的测定结果进行比较。称取样品约 2.0 g,精密称定，置于圆底烧瓶中 , 加入 25 ml 石油醚浸提1h, （加热温度： 80） ,过滤后药渣用 40 ml 85% 的乙醇提取两次，每次加热回流提取 2 h, 过滤，合并提取液 , 用旋转蒸发仪浓缩近干，将浓缩液转移至10ml 容量瓶中 , 用甲醇定容 , 摇匀 , 经 0.45 m滤膜过滤 , 即得。按此提取方法提取所得样品溶液用 HPLC在相同的色谱条件检测，发现在保留时间为 10.5 min 和 20.1 min 时没有任何峰出现，说明未经酸水解的提取物中不含木犀草素和芹菜素。由此可以判定提取物中木犀草素和芹菜素几乎全部以糖苷的形式存在。【参考文献】 1 国家药典委员会 . 中国药典，部 S . 北京：化学工业出版社，2005：259.2 汤海峰 , 赵越平 , 蒋永培 . 中药墨旱莲的研究概况J. 西北药学杂志 ,1999,14(1):32.3 张 梅,
