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1、光学显微镜的原理和应用简介一、光学显微镜发展历史与最新进展 已近 400 年的历史。十九世纪之前发展非常缓慢。1665年：英国物理学家RHoock的第一台显微镜的雏形。 十八世纪初：慧更斯目镜的发明。十九世纪中： Lister 和 Amici 制造了消色差物镜，部分消除了色差，后者首次制成水浸物镜， 使数值孔径NA1。1886 年: Ernst Abbe与Carl Zeiss第一个生产出了复消色差物镜，消除了球差和色差的干 扰，提高了数值孔径(14)，并奠定了现 代光学理论原理。1893年：August Koler教授发明了著名的柯勒照明。1890-1899年：金相显微镜、消像散透镜和双 筒目
2、镜以及第一台体视显微镜 的诞生 。 二十世纪初：出现了齐焦物镜 。1932 年底： 诞生了透射电子显微镜，电子显微镜的分辨率是传统光学显微镜的 1000倍以 上。19301940年：显微分光光度计的出现，预示着显微定量技术的开始。19401950年：出现了荧光显微镜。二次大战之前： Zeiss 公司基于诺贝尔奖获得者荷兰物理学家 Frits Zernike 的光学理论制 造了第一台观察活细胞的相差显微镜。1955年：物理学家Georges Nomarski改良了 Wollaston棱镜，诞生了另外一种增强活细胞反差技术的显微镜一 Nomarski干涉显微镜即微分干涉差显微镜。1975年：Rob
3、ert Hoffman又提出了一种增强活细胞反差的技术，即Hoffman调制相差显 微镜。1970一80 年：医学图像处理与分析系统1970一80 年：流式细胞仪1980一90年：诞生了激光扫描共焦显微镜。比普通光学 显微镜的分辨率提高了 15倍。80年代末和 90年代初：诞生了双光子扫描显微镜。二十世纪90年代末至今：全内反射显微镜，物镜数值孔径达到了 16。分辨率：普通光学显微镜：xy- 0.25 gm共焦显微镜：xy- 0.18 gm, z- 300nm全内反射显微镜 ： z- 100nm4pi： zv100nmSTED： xy- 20nm透射电镜： xy- 0.1nm二、生物光学显微镜
4、主要种类：眀场透射光显微镜: 观察经过组化染色的标本。暗视野显微镜：适于观察未染色的标本一活细胞。 散射光成像。 相差显微镜：适于观察活细胞。光相位差转换成振幅 差。微分干涉差显微镜: 适于观察活细胞。利用双束偏振光的干涉增强反差。 荧光显微镜： 观察标记了荧光探针的样品（活细胞或 固定样品）。 偏振光显微镜： 利用偏振光观察晶体结构或具有双折射性的结构，如 : 细胞骨架、纤 维、 膜。Hoffman 调制相差显微镜：观察活细胞三、光学显微镜的基本组成 光学显微镜主要由光学成像部分和机械结构部分组成。光学成像：物镜、目镜、照明系统、滤片系统 机械结构：镜座、镜臂、载物台、镜筒、 物镜转换器、调
5、焦装置光学成像部分：（一）物镜1组成和作用：由凹凸透镜组成，直接使样品成放大倒立 的实像（放大 1 100 倍）。物镜 品质的好坏、档次的不同决定了整个显微镜的质 量。2分类1）按介质不同分类： 干燥物镜（简称：干镜）（空气 n=1） 油浸物镜（简称：油镜）（油 n=1.515） 水浸物镜（简称：水镜）（水 n=1.333）2）按校正像差分类：消色差物镜（achromatic objective） 平场消色差物镜（ plan objective） 平场半复消色差物镜（plan fluotar objective） 平场复消色差物镜（ plan apochromatic objective）3）
6、按工作距离分类 长工作距离物镜 普通工作距离物镜4）按功能分类相差物镜偏振光物镜 微分干涉差物镜5）按镜筒长度分类 有限远物镜 无限远物镜（二）目镜组成和作用：由凹凸透镜组成，将物镜形成的倒立实像放大为 10-16倍的虚像。按目镜视场数可分为：非广角目镜、广角目镜、 超广角目镜等。对于10 X目镜而言，视场数18mm,常称为非广角目镜。视场数M 18mm,常称为广角目镜。视场数20mm,常称为超广角目镜。（三）照明系统1视场光阑2聚光器3光源1. 视场光阑 视场光阑常位于支架底座上，其光阑大小能连续改变，它通过聚光镜能清晰地成 像在标本面上。所以在目镜中看清标本的同时也能看到视场光阑多边形或圆
7、形图像。可变 视场光阑的像应外切于目镜中的视场光阑，使光线只能照明需观察的标本，尽可能减少标 本四周的散射光。2聚光镜（器）组成和作用： 由前端透镜、可变孔径光阑组成。作用是改变入射光的强度，调节光束大小，使光源 发出的光线形成一束与物镜数值孔径大小相适应的光束，达到均匀照明标本的目的。可变孔径光阑 可变孔径光阑是聚光镜中非常重要的装置，由于各个物镜的数值孔径不同， 要求照明光束的孔径角也相应的变化,因此,，聚光镜中必定有一个能连续改变照明孔径角的可变光阑 此光阑即为可变孔径光阑。3光源1）照明光源：天然 ：阳光人工 ：卤素灯、高压汞灯、氙灯2）照明方式：分透射照明和落射照明简介I） 透射照明
8、：光源来自标本下方，透过样本到达物镜，透射照明光源通常采用卤素灯。目前最常见的透射照明方式：柯勒照明II）落射照明：光束通过物镜落射到标本上，物镜收集反射光，进而成像。物镜本身又作为聚光镜。主要用于荧光显微镜、反射光显微镜和偏光显微镜。通常荧光显微镜采用 高压汞灯或氙灯 作为光源。（四）、滤片系统1普通滤片分三类： 日光型滤片：用于矫正色温，把显微镜灯光的色温转变为（DFL）阳光的色温，使彩色照片颜色还原正确。中性滤片：使光源的光减弱，对波长无选择性，也不改变（ N4） 色温。 补偿滤片：如染色为红色可选用绿色滤片增加反差。（GREEN）2荧光滤片详见第四节（荧光显微镜）第一节 透射光显微镜一
9、、光路结构与原理第一节 透射光显微镜1成像：物体在物镜后方形成倒立放大实像 （此像在目镜焦点以内） 通过目镜形成倒立放大虚像(此像在眼睛明视野25cm以内)通过晶状体在视网膜上成为正立的像。2焦点： 凸凹透镜焦点，凸为实焦点，凹为虚焦点。3. 透镜成像的基本特性-平行于光轴的入射光通过透镜的焦点出射。 -通过焦点的入射光平行于透镜的光轴出射。-通过透镜轴心的入射光出射方向不变。4. 有限远光路特点：1) 物体位于物镜前焦点之外2) 非平行光路3) 镜筒长度：物镜后焦面至目镜前焦面的距离 (160mm)。5.无限远校正显微镜光路(Zeiss,1824年提出；1980年后应用)特点：1) 物体位于
10、物镜的前焦平面上2) 为平行光路3) 具有镜筒透镜二 物镜的性能1 数值孑径(numeric aperture NA)数值孔径是物镜最重要的参数之一， 它直接影响物镜的分辨率和物镜的光亮度。NA=nx Sin un：物镜与样品之间介质的折射率u： 1/2孔径角，进入物镜口边缘入射光束与物镜光轴之间的夹角增大u和n,可以增大NA干燥物镜：介质为空气n= 1NA： 0.05 095水浸物镜：介质为水n 1.33NA： 0.71.25油浸物镜：介质为镜油(香柏油)n 1.5NA： 0.851.4工作距离：物镜前透镜与样品之间的距离为工作距离。距离越短，u越大，NA越大。通常物镜的最大数值孔径为1.4
11、,但现在有一种特殊物镜，其数值孔径可达16,这类物镜 用于全内反射显微镜。2.分辨率(resolution power R)区分物平面两个点间最小距离为分辨距离即分辨率，它代表分辨微细结构的本领。R = 0.61 九 / NA (R=0.61/2 NA)入:光波波长(通常入=550nm)NA ：物镜数值孔径若，NA=1.4，波长九：550nm贝 U R= 0.61X 0.55/1.4=0.24p0.25 p是光学显微镜的极限分辨率数值孔径越大，波长越短，分辨率 数值越小，而显微镜分辨能力越高。AI= 26.4%d=0 61 九 / NA光学极限分辨率是由光的衍射特性决定的3. 放大率(magn
12、ification M)放大率(M)幽镜放大率(MJ X目镜放大率(M2)物镜放大率：Mj=A / Fj有限远光路：A：镜筒长度，物镜后焦面至目镜前焦面的距离(160mm)。Fj物镜焦距。无限远光路： A： 镜筒透镜的焦距目镜放大率： M2= 250 / F2250mm：眼到物的明视距离f2：目镜焦距。M2的放大率不超过16倍。4. 景深焦点深度( focal depth) DF景深表示清晰的像平面所能对应物平面前后空间的深度；或指焦点与样品上某点 相一致时，能看清这一点及其上下两侧的结构，那麽，清晰部分的厚度即景深，也称之为 焦点深度。Df= 1/7NA*M +A /2NA2式中：DF ：景
13、深NA : 数值孔径 NAM ：总放大率入：光波波长，单位:mm注：放大倍数越大，数值孔径越大，显微镜景深越小。5镜像亮度(light of image, L)镜像亮度与数值孔径的平方呈正比，与总放大率的平方呈反比。L = NA2/ M2,M2 =(叫 x M2)2V N -注意：在同一放大率下选用不同数值孔径的物镜，其镜像亮度不同。数值孔径越高，镜 像亮度越高。数值孔径相同或相差不大的情况下，物镜倍率越高，镜像亮度越暗。这一点 在观察荧光样品时尤其要注意，应权衡选用适当的物镜。NA对荧光图像的亮度尤其重要。6. 物镜工作距离物镜工作距离越长，NA越小。Confocal 中要观察厚的样品时，在
14、相同倍率下，数值孔径接近的情况下，应选择工作距离长的物镜来观察。63x/1.32 oil L: 0.07mm63x/1. 2 w L: 0.22mm聚光镜 组成和作用： 由前端透镜、可变孔径光阑组成。作用是改变入射光的强度，调节光束大小，使光源 发出的光线形成一束与物镜数值孔径相适应的光束，达到均匀照明标本的目的。 可变孔径光阑可变孔径光阑是聚光镜中非常重要的装置，由于各个物镜的数值孔径不同 ,要求照明光 束的孔径角也相应的变化,因此,聚光镜中必定有一个能连续改变照明孔径角的可变光阑，此 光阑即为可变孔径光阑。聚光镜分为干、湿两种。所谓“湿”即使用时需滴上浸液这类聚光镜NA为1.21.4。“干
15、”使用时不需滴浸 液,NA常为09。徕卡还备有干、湿两用的聚光镜，NA 0.9/NA 125。数值孔径为 0.9的聚光镜与孔径为 1.25的 100倍油镜配合使用,其分辨率不会降低。 因为可变孔径光阑的大小可以为物镜数值孔径的2/3 3/4，即125*3/4=0.94,NA0.9干聚光镜 正好与之相适应,也免去操作者滴油及清洁的麻烦。对于特别追求鉴别率的场合 ,则应采用湿聚光镜,使用时,应在载玻片与聚光镜上表 面滴上相应的浸液。柯勒照明：是一种较为完善的照明方式，目的是得到最好的反差和最清晰的图像。严格的柯勒照明必须符合下面三个条件：照明均匀，灯丝像位于聚光镜的前焦面上，通过聚光镜以平行光束照明标本。孔径光阑大小可任意改变，以适应不同倍率物镜的需要。 具有可变的视场光阑，以适应不同倍率物镜的不同照明范围需要。第二节 物镜的分类和标识一、物镜的分类（一）按像差校正程度分类：
