《藻胆蛋白生物合成与光谱分析(教案).doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《藻胆蛋白生物合成与光谱分析(教案).doc（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、藻胆蛋白生物合成与光谱分析【课前预习】1无菌操作技术。2凝胶电泳、锌电泳、亲和层析技术的基本原理。【目的要求】1了解藻胆蛋白生物合成的途径2掌握藻胆蛋白纯化的基本方法。3熟悉用分光光度计和荧光光谱仪测定藻胆蛋白光谱特性的方法。【基本原理】藻胆蛋白（phycobiliprotein）是一类结构相似的色素蛋白。它是由藻胆色素通过和相应的脱辅基蛋白中保守性半胱氨酸的巯基以硫醚键共价结合形成的。根据色素种类及其与藻胆蛋白的相互作用，藻胆蛋白可分为藻蓝蛋白（phycocyanin，简称PC）、藻红蛋白（phycoerythrin，简称PE）和别藻蓝蛋白（allophycocyanin，简称APC），在某
2、些没有藻红蛋白而具有异形胞的蓝藻中，还有藻红蓝蛋白（phycoerythrocyanin，简称PEC）。每种藻胆蛋白分别由各自的a亚基和亚基构成（部分藻胆蛋白中还存在亚基）。藻胆蛋白通过脱辅基蛋白质三级结构和藻胆色素相互作用，形成特定的构象，使其主要吸收450660nm范围内的可见光。藻胆蛋白所能捕获的光能正好可以填补叶绿素和类胡萝卜素所不能捕获的光能区（图1）。捕获的光能由高能色素流向低能色素，最终传递到光合作用中心。 图1 色素蛋白吸收光谱藻胆色素是一类线性四吡咯化合物（分子量约600Da）。藻胆体中一般含有300800个共价偶联的藻胆色素。与蓝藻藻胆蛋白结合的色素有4种。这四种色素分别是
3、：藻红胆素（phycoerythrobilin，简称PEB）主要存在于PE中，藻蓝胆素（phycocyanobilin，简称PCB）主要存在于PC，APC和PEC中，藻尿胆素（phycourobilin，简称PUB）主要存在于B-PE和R-PE中，藻紫胆素（phycoviolobilin，简称PVB）仅存在于PEC中。藻胆色素来源于血红素，血红素被氧化而共轭环断裂形成胆绿素，这一过程是由相应的血红素氧化酶催化。胆绿素被特定的酶部分还原和异构化形成特定的藻胆色素（图2）。图2 藻胆胆素生物合成途径藻胆色素与多肽链的保守性Cys残基形成硫醚键共价连接，连接过程是由相应的裂合酶催化（表1）。在蓝藻中
4、，藻胆色素均通过3位与多肽链中保守的半胱氨酸残基形成硫醚键而共价连接，并通过与蛋白质三级结构相互作用，形成特定的构象，使藻胆蛋白主要吸收450660nm范围内的可见光。表1 裂合酶催化类型裂合酶类型催化产物E/F-型PCB-CpcA，PVB-PecAS/U-型CpcB-C84-PCB，PecB-C84-PCB，CpeA-C84-PEB，CpeB-C84-PEB ，ApcA,B,D,F-PCBT-型CpcB-C155-PCB ，PecB-C155-PCB【实验用品】1材料：菌种（E.coli，BL21）2器材和仪器：紫外分光光度计、荧光光谱仪、层析实验冷柜、pH计、紫外检测仪、高速冷冻离心机、超
5、声破壁仪、制冰机、低温恒温槽、电泳仪、振荡培养箱、净化工作台、高压灭菌锅3超声缓冲液 0.5mol/L NaCl、20mmol/L磷酸钾缓冲液，pH7.24亲和层析法提纯蛋白质溶液0.5mol/L 氯化镍柱平衡液：0.5mol/L NaCl、20mmol/L磷酸钾缓冲液，pH7.2洗脱液：50mmol/L咪唑、0.5mol/L NaCl、50mmol/L 磷酸钾缓冲液(pH7.2)洗脱液：500mmol/L咪唑、0.5mol/L NaCl 、50mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.2)透析液：50mmol/L KPP,0.5mol/L NaCl，pH7.25LB培养基液体培养基：1蛋白胨、0.5
6、酵母粉、1 NaCl，pH7.0固体培养基：液体LB培养基中加入1.5琼脂6SDS-PAGE电泳溶液5Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱、94g甘氨酸(pH8.3)、50mL 10 SDS1SDS凝胶加样缓冲液：50mmol/L TrisCl(pH6.8)、100mmol/L DTT、2 SDS(电泳级)、0.1溴酚蓝、10甘油（DTT配制成1mol/L储存液，-20C保存，用前加入）2SDS凝胶加样缓冲液：100mmol/L TrisCl(pH6.8)、200mmol/L DTT、4 SDS(电泳级)、0.2溴酚蓝、20甘油脱色液：由90mL甲醇:水（1:1，V:V）与10m
7、L冰乙酸混合而成染色液：在100mL脱色液中溶解0.25g考马斯亮蓝R2507抗生素储备液氯苄青霉素储备液：用无菌二次重蒸水配成100mg/mL氨苄青霉素（ampicillin，简称Amp）溶液，分装，-20C保存备用。使用时每毫升培养基加入0.71mL，终浓度为70100mg/mL。卡纳霉素储备液：用无菌二次重蒸水配成10mg/mL卡那霉素（kanamycin，简称Kan）溶液，分装，-20C保存备用。使用时每毫升培养基加入35mL，终浓度为3050mg/mL。氯霉素储备液：用无水乙醇配成34mg/mL氯霉素溶液，分装，-20C保存备用。使用时每毫升培养基加入0.60.8mL，终浓度为202
8、7mg/mL。链霉素储备液：用无菌二次重蒸水配成20mg/mL链霉素溶液，分装，-20C保存备用。使用时每毫升培养基加入2.53.0mL，终浓度为5060mg/mL。8IPTG储备液：将2g异丙基硫代-b-D-半乳糖苷（isoprophyl thio-b-D-galactoside，简称IPTG），溶于二次重蒸水中，过滤除菌，分装，-20C保存备用。【方法步骤】1活化菌种：取保藏的工程菌菌种10 l接入装有5 ml的LB液体培养基的试管（不同的藻胆蛋白生物合成需要不同的抗生素）中，于37摇床振荡培养8-12小时。2扩大培养：将试管中活化的1 ml菌液接种到250 ml LB培养基，同时加入对应
9、的抗生素，培养基于37摇床振荡培养。3色素蛋白生物合成：工程菌培养至OD600约为0.5-0.6，10水浴中放置1 hr，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，20低温过夜诱导后离心收集细胞，二次蒸馏水洗两次。4色素蛋白纯化： 将洗好的细胞重悬于一定量的超声缓冲液中，用超声波细胞粉碎仪进行超声破碎细胞5 min，然后于12000g离心15 min。取上清加到用柱平衡液预平衡好的Ni2亲和层析柱上，三次柱平衡液洗柱，洗脱杂蛋白采用洗脱液，收集色素蛋白采用洗脱液。洗脱产物用透析液透析三次，每4小时换一次透析液以去除咪唑。5色素蛋白电泳检测 （1）安装双垂直板电泳槽； （2）配胶：12%的分离胶15
10、 ml，浓缩胶5 ml；（3) 制样：取样品10 1加样品缓冲液40 1混合，100加热5 min，12000g，4离心1 min；（4）上样：用微量注射器加样15-20 1；（5）电泳：在凝胶上加80V/cm电压，待前沿指示剂进入分离胶后将电压提高到140V/cm继续电泳直到指示剂到达底部；（6）锌染色：电泳胶室温下经1.5 mol/L醋酸锌溶液浸泡30分钟后，在280nm紫外灯下检测。紫外灯照射下拍照；（7）清洗：将已拍照的凝胶用二次重蒸水清洗2次；（7）固定和染色：用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡；（8）脱色：用脱色液处理直到胶板呈现浅蓝色。6光谱分析 吸收光谱用紫外可见光谱仪，紫外可见
11、光谱扫描范围300800nm，扫描速度960nm/min，狭缝宽度1.0nm。荧光光谱用荧光光谱仪，荧光光谱扫描速度1200nm/min ,狭缝宽度5.0nm。【结果与分析】1提纯样品2电泳的结果3吸收和荧光图谱【注意事项】1藻胆蛋白生物合成过程必须在低温、避光条件下进行。2超声波破壁时必需在冰上进行，否则因升温导致藻胆蛋白的失活，影响最终的光谱。【思考题】1提交藻胆蛋白的纯化结果，包括光谱和电泳图谱。2讨论实验的过程和结果。【参考文献】1Tooley A J, Cai Y A, Glazer A N. Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial
12、C-phycocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host. Proc Natl Acad Sci USA, 2001；98(19):10560105652Tooley A J, Glazer A N. Biosynthesis of the cyanobacterial light-harvesting polypeptide phycoerythrocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host. J Bacteriol, 2002；184(17):466646713Zhao KH, Su
13、 P, Li J, Tu JM, Zhou M, Bubenzer C, Scheer H. Chromophore attachment to phycobiliprotein beta-subunits: phycocyanobilin:cysteine-beta84 phycobiliprotein lyase activity of CpeS-like protein from Anabaena Sp. PCC7120. J Biol Chem. 2006；281(13):8573-814Zhao KH, Su P, Tu JM, Wang X, Liu H, Plscher M, Eichacker L, Yang B, Zhou M, Scheer H. Phycobilin:cystein-84 biliprotein lyase, a near-universal lyase for cysteine-84-binding sites in cyanobacterial phycobiliproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 2007；104(36):14300-5.
