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1、益气化瘀方及其拆方对大鼠椎间盘纤维环细胞凋亡相关因子的作用周泉,王拥军,施杞,孙鹏,周重建,胡志俊,刘梅【关键词】,益气化瘀方摘要目的：研究益气化瘀方及其拆方药理血清对大鼠诱导凋亡椎间盘纤维环细胞bl2、Bax及半胱氨酸蛋白酶8aspase8表达的影响。方法：用细胞免疫化学和积分光密度分析等方法比拟分析益气化瘀方及其拆方益气方、化瘀方药理血清，以及胰岛素样生长因子1insulinlikegrthfatr1,IGF1对抗Fas抗体antiFasantibdy诱导凋亡大鼠椎间盘纤维环细胞bl2、Bax及aspase8表达的影响。结果：益气化瘀方、益气方、化瘀方及IGF1血清处理组与凋亡模型组相比，
2、bl2表达升高，Bax及aspase8表达降低，均有统计学意义P0.01；益气化瘀方组与益气方、化瘀方组比拟，Bax表达明显降低，有统计学意义P0.05。结论：益气化瘀方及其拆方可以调控大鼠椎间盘纤维环细胞内Bax、bl2和aspase8表达，其延缓椎间盘退变的机制可能与调控细胞的凋亡相关因子有关。关键词益气化瘀方;椎间盘;纤维环细胞;bl2;Bax;aspase8EffetsfYiqiHuayuReipeanditsdepsedfrulasnapptsisrelatedfatrsfanulusfibrsusellsinratsABSTRATbjetive:TstudytheeffetsfYi
3、qiHuayuReipeanditsdepsedfrulasediatedseranexpressinsfbl2,Baxandaspase8fappttianulusfibrsusellsinrats.ethds:IunhistheialandintegralptialdensityanalytiethdsereusedtbservetheeffetsfYiqiHuayuReipe,YiqiReipe,HuayuReipeediatedseraandinsulinlikegrthfatr1(IGF1)ntheexpressinsfbl2,Baxandaspase8fappttianulusfi
4、brsusellsinratsinduedbyantiFasantibdy.Results:Asparedithapptsisgrup,bl2expressinashigher,Baxandaspase8expressinserelerinYiqiHuayutreated,Yiqitreated,HuayutreatedandIGF1grups(P0.01).AsparedithYiqitreatedgrupandHuayutreatedgrup,BaxexpressinaslerinYiqiHuayutreatedgrup(P0.05).nlusin:YiqiHuayuReipeandits
5、depsedfrulasandelaydegeneratinftheervialintervertebraldis,hihaybeduetitsatininregulatingtheexpressinsfbl2,Baxandaspase8.KEYRDSYiqiHuayuReipe;intervertebraldis;anulusfibrsus;bl2;Bax;aspase8椎间盘退变主要表现为椎间盘细胞的凋亡和细胞外基质合成与分泌的减少,椎间盘细胞自分泌和旁分泌Fas配体触发凋亡。益气化瘀法是施杞教授根据大量临床和实验研究总结出来的治疗颈椎病的法那么，本研究讨论其对椎间盘细胞凋亡相关因子的作用
6、。1材料与方法1.1主要试剂、仪器与材料达氏修正依氏培养基DulbesdifiedEaglesediu,DE，Gib公司产品；粗品胶原酶，上海市医药工业研究院产品；胰蛋白酶，Prega公司产品；小牛血清，杭州四季青生物制剂公司产品；鼠抗人bl2蛋白单克隆抗体，兔抗人Bax蛋白单克隆抗体，链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物试剂盒，Dak公司产品；兔抗人aspase8蛋白单克隆抗体，Santaruz公司产品；2培养箱，HeraeusB5060EK2；SB1超净台，上海净化设备厂产品；倒置显微镜，lypus公司产品；120目尼龙网筛过滤器、培养瓶，Unln公司产品；IAS99B型医学图像系统，北京航空
7、航天大学图像中心产品；益气化瘀方黄芪、党参、川芎、丹参，人工麝香，益气方黄芪、党参，化瘀方川芎、丹参，人工麝香1。1.2细胞培养及分组1月龄大鼠，无菌手术条件下，取下颈部椎间盘纤维环，采用连续酶消化法别离、培养2。细胞生长铺满瓶底后，用0.25%胰蛋白酶消化，传代，将代细胞以2104/l密度接种于内置玻片的6孔培养板和培养瓶内，培养第5天时，换无血清培养液孵育，24h后去上清液，参加含1%小牛血清DE配制的抗Fas抗体，浓度为0.25g/l，继续培养12h后，分为6组：正常对照组、凋亡诱导组、中药血清治疗组益气化瘀方、益气方和化瘀方1、重组人IGF1RDSystesIn产品，用1小牛血清配制成
8、终浓度为50ng/l组，再孵育48h，然后搜集细胞进展观察。1.3Bax、bl2和aspase8细胞免疫化学法检测取纤维环细胞玻片，磷酸盐缓冲液(phsphatebufferedsaline,PBS)洗涤，4%多聚甲醛固定30in，PBS洗涤3in，3次；85%、95%和100%乙醇脱水，用中性树脂将盖玻片无细胞面贴在载玻片上，自然风干；0.3%H22室温20in，PBS洗涤3in，3次；0.1%Tritn100PBS洗20in，PBS洗涤3in，3次；参加一抗；4冰箱过夜，PBS洗涤3in，3次；参加二抗为生物素化羊抗兔IgG1400，37，30in,PBS洗涤3in，3次；抗生物素蛋白链菌
9、素streptavidinHRP(1400)，37，40in，PBS洗涤3in，3次；0.05%联苯二胺加0.03%H22，12in；苏木素衬染，常规封片。阳性结果判断：染色阳性表达为棕黄色，无着色为阴性。以不加一抗为阴性对照。1.4图像分析取免疫组化染色玻片，200倍光学显微镜下，在上下的根底上，再分左、中、右，共观察6个视野，使用IAS99B型医学图像系统，用积分光密度对阳性信号进展量化分析。1.5统计学方法用SPSS10.0统计软件包，进展单因素方差分析。2结果正常对照组的Bax和aspase8积分光密度低，轻度表达；凋亡诱导组的Bax和aspase8积分光密度高，表达明显，高于正常对照
10、组(P0.01)；正常对照组的bl2积分光密度高，bl2高度表达；凋亡诱导组的bl2积分光密度低，表达不明显，与正常组比拟有统计学意义(P0.01)。3种中药药理血清及IGF1组和凋亡诱导组比拟，Bax和aspase8呈明显的下调，而bl2呈明显的上调，差异有统计学意义(P0.01)。益气化瘀方组与益气方、化瘀方组比拟，Bax表达明显降低P0.05。见表1。表1bl2、Bax和aspase8积分光密度结果略Tab1Integralptialdensityresultsfbl2,Baxandaspase8*P0.05,vsYiqiHuayutreatedgrup;P0.05,P0.01,vsnr
11、alntrlgrup;P0.01,vsapptsisgrup3讨论椎间盘退变是颈椎病发病的主要原因，细胞凋亡是椎间盘退变的主要表现，椎间盘细胞自分泌和旁分泌Fas配体触发的凋亡为其机制之一3,4。Fas是一种跨膜蛋白，它与Fas配体Fasligand,FasL结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡。椎间盘细胞按来源部位可分为3种：纤维环细胞、髓核细胞和软骨终板细胞。本文纤维环细胞凋亡研究为椎间盘细胞学研究中的局部内容。中医学认为颈椎病属于“痹症、“痉证、“痿证、“痰饮、“内伤、“眩晕、“头痛等病证范畴。颈椎病外因包括风寒湿、慢性劳损、咽喉部感染等因素，内因乃正气虚弱、气血失调、脏腑不和。“血行
12、失度，随损伤之处而停积，所以“时损痛也；荣养渎职，引起了不荣那么痛和肢麻等病症。所谓“积劳受损，经脉之气不及贯串，“血气不和，百病乃变化而生。施杞教授在“气血兼顾，以气为主，以血为先理论的根底上，结合颈椎病临床观察和实验研究，提出“益气化瘀、标本兼顾治疗颈椎病之法那么5。sada等6研究证实，在正常的椎间盘与退变的椎间盘中，IGF1RNA表达有明显差异。Gruber等7发现体外培养椎间盘细胞中参加IGF1和血小板衍生生长因子plateletderivedgrthfatr,PDGF有明显抗凋亡作用。因此，本研究选用IGF1作为对照药物。细胞凋亡的过程实际上是aspase不可逆有限水解底物的级联放
13、大反响过程。aspase8前体可被Fas的死亡构造域激活8，并被募集到Fas和肿瘤坏死因子受体1死亡受体复合物，水解活化，启动aspase活化后，即开启细胞内的死亡程序9，10。aspase引起线粒体浸透性转变孔(ithndriapereabilitytransitinpre,PTP)的翻开，导致线粒体的跨膜电位下降，同时细胞色素被释放到胞质中，凋亡抑制因子bl2被灭活。bl2的生理功能是阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命，它在不同的细胞类型可以定位于线粒体、内质网以及核膜上，并通过阻止线粒体细胞色素的释放而发挥抗凋亡作用。bl2的过度表达可引起细胞核谷胱苷肽的积聚，导致核内氧化复原平衡的改变，从而降
14、低了aspase的活性。aspase介导细胞凋亡的信号传导，与凋亡效应器细胞色素、bl2蛋白家族间互相作用。Bax是bl2家族中参与细胞凋亡的一个成员，当诱导凋亡时，它从胞液迁移到线粒体和核膜，增加线粒体膜的通透性11，造成细胞色素从线粒体膜间隙释放到胞质12。抑制Bax基因表达，进步bl2/Bax比值，有可能会抑制凋亡、促进细胞存活13，14。在椎间盘退变研究中，李小川等15发现退变腰椎间盘组织中bl2蛋白表达越弱，Bax蛋白表达越强，凋亡细胞数越多。认为bl2和Bax蛋白均参与了腰椎间盘组织中细胞凋亡的调节，并在腰椎间盘退行性变发生和开展中发挥着重要作用。本课题组前期研究发现益气化瘀方可以
15、增加椎间盘营养供给16，17，促进神经元的增生，加快神经肌肉接头的重建，显著缩短神经再生修复的进程18，抑制退变椎间盘中炎症介质19，上调型胶原RNA的表达20，对椎体骨赘内血清碱性磷酸酶活性21和椎间盘中生长因子具有调控作用22，23。颈椎间盘退变与椎间盘细胞凋亡有关，芪麝颈康丸益气化瘀药为主组成有抑制椎间盘细胞凋亡的可能性24。我们使用免疫细胞化学法观察3种中药血清(益气化瘀方、益气方和化瘀方)和IGF1对抗Fas抗体诱导凋亡纤维环细胞Bax、bl2和aspase8的表达的影响，3种中药药理血清以及IGF1均下调Bax和aspase8，上调bl2，这说明益气化瘀方可能通过增强bl2表达而降低了aspase8的活性，阻断了Fas死亡信号的传导和执行，中药血清有生长因子IGF1样作用，这可能是其抑制凋亡的机制所在。益气化瘀方与益气方和化瘀方比拟，Bax表达差异有统计学意义，益气化瘀方作用优于拆方。本研究在细胞学程度证实益气化瘀方对纤维环细胞凋亡的影响可能是通过调节凋亡相关因子实现的，提示益气化瘀方延缓椎间盘退变的机制，可能是通过对椎间盘纤维环细胞凋亡的调控而产生。参考文献1王拥军,孙鹏,周泉,等.益气化瘀中药对大鼠椎间盘软骨细胞基因表达的影响J.中西医结合学报,2022,3(2):111114.2周泉,王拥军,施杞.椎间盘纤维
