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1、PBMC分离及冻存流程本实验采用密度梯度离心原理（Ficoll密度为1.077,PBMC平均密度为1.072）,并通过反复离心洗涤，获得相对较纯的PBMC。1.试剂与耗材DPBS（PH=7.4,GIBCO,C14190），RPMI1640（GIBCO,C22400），FBS（GIBCO,10099），Ficoll分离液（LymphoprepTM,1114740）,台盼蓝（Sigma,117K2332）,DMSO（Sigma,D5879-11）,15ml和50mlFalcon离心管2. 缓冲液配置P0：即不含FBS的PBSR0：即不含FBS的RPMI1640R10：即10%FBS的RPMI164
2、0冻存液：即含10%DMSO的FBS所有液体配置后4C保存，使用前30分钟平衡至室温。3. 分离步骤（以每份血样25ml为例）1）在分离前30分钟，准备超净台，将缓冲液（P0,R10）和Ficoll分离液复温至室温；每个患者20ml的肝素钠抗凝血（绿色帽管），需要50ml离心管2个，15ml离心管34个2）登记样本基本信息，姓名，ID号，采血日期；3）650g离心7min，30ml血一共可留取34ml血浆（2mlep管圆底的3管），以尽量不吸取到红细胞为原则，注意无菌操作，巴斯管不能伸进ep管。4）吸取的血浆离心3000rpm，10min,吸取上清。5）每位患者需要分装为4管血浆（1.5mle
3、p管），血清视情况（10ml普通帽管）而定，1.5ml离心管每管1ml；5ml普通管中吸出300400ul到1.5mlEP管中，标记后和HBVDNA申请单卷在一起，然后把5ml的普通管与雅培申请单卷在一起，送到血清室，反别放入相应的盒子中（盒子在台上或在透明玻璃门冰箱里），血清血浆放到小实验室卧室冰箱中。6）在50ml离心管中，加入PBS（2倍稀释），用巴斯管反复混匀剩下的血，倒入离心管中，反复混匀再转移至加入5mlFicoll分离液的15mlFalcon离心管3或4管（这样的分离效果会均匀一些，避免有一些管PBMC多一些）7）个别患者离心完第1步之后可能会呈现云雾状细胞团，吸取PBMC之后吹
4、散即可，离心完第2步之后一定要彻底打散细胞。）8）将稀释的血液缓慢加入Ficoll分离液的表面（倾斜45度）；9）按程序1离心（800g，25分钟，室温，加速/减速设置为1）；10）轻柔的收集淋巴细胞带置于新的50mlFalcon离心管（1支），并加入PBS至50ml；尽量避免吸到分离液。11）按程序2离心（1800rpm，10分钟，室温，加速/减速设置为9）；12）弃去上清，轻弹管底打散细胞沉淀，并将细胞在4mlR10及16mlPBS中重新混悬；13）进行细胞计数（吸取20ul细胞悬液到计数板中，humanfreshPBMC,稀释20倍,校正）;等记，每58X106个细胞为一管14）按程序3
5、进行离心（1500rpm，10分钟，室温，加速/减速设置为9）；15）弃去上清，轻弹管底打散细胞沉淀，按下一步实验要求用冻存液调整细胞浓度或冻存。4.冻存步骤1）预先配制相应体积的冻存液，置4C冷却；2）在冻存管上标记样本姓名，冻存日期；3）接上述第15步，按68*106/ml密度计算冻存管数，按lml/tube添加冻存液；4）将添加冻存液的细胞轻柔混匀后，lml/tube分装至细胞冻存管；5）将冻存管置于细胞梯度冻存盒，后者置于-80C冰箱（4号）；5.注意事项1）全过程无菌操作，动作轻柔细致；2）实验前必须将各种缓冲液和Ficoll平衡至室温，有必要可采用37C水浴加热；3）第6步尽可能将所有PBMC吸取干净而少吸取Ficoll分离液；4）计数取样前务必充分混匀以确保计数准确；5）添加冻存液后细胞脆性增加，混匀时应该动作轻柔。6）冻存盒用了5次后应补充异丙醇。使用冻存盒务必先用吸水纸擦干孔的水，以免低温冻存后冻存管与冻存盒粘连，抹掉管上的字迹。使用后在冻存盒试用本登记。
