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1、PCR扩增失败的原因分析2010-12-13 16:48:31|分类：默认分类|字号订阅PCR扩增失败原因分析，PCR产物电泳2010-05-15 16:07一 模板质量问题： 1）模板提取不完整，其中不含你的目的基因，或目的基因含量太低。可以跑个电泳看看提取的DNA，PCR阳性样品与阴性样品是否有明显差别。如果确定是这种问题，可以增加模板量试试，但不一定行得通。2）模板里面残留某种试剂成份，可能抑制Taq聚合酶的活性，如果是这种情况，可以用试剂盒把模板再纯化一下，或将模板做个梯度稀释以确定最佳的模板量。3） 为什么跑电泳会出现拖带呢？ 1. 有可能的因为你的电压调的太高了。电泳跟很多因素有关
2、，其中就有一个是电压，在适当的电压范围内增加是可以加快迁移速率，但是要是超到一个临界值反而有害。你可以适当的调低点看看。 2.有时候发现上样量太多的话会有拖带。你看能否回收之后 ，按1:50 或1:100 等稀释后，再当成模板扩一次怎么样。二 引物问题 1）样品自身的基因型差异导致扩增失败。也就是说你的引物与某些基因型的样品结合的好，而和另一些基因型结合不好。可以换一对更保守的引物试试。祝顺利！ 2）普通PCR所用的一对引物中有一个引物加多了，为正常的三倍只要引物特异性比较好，那么不会产生大的影响。如果恰巧是加多的这条引物不是很特异的话，也许会扩出来非特异带。在制备单链探针时候就采取这样的不对
3、称pcr，没关系的三 Taq酶处于失活状态。因为活性降低了能出现二聚体。tap酶种类高特异性Taq酶 高度特异性地扩增所需的片段是PCR最基本的要求，影响PCR特异性的因素很多，包括模板、引物性质及质量、反应条件的控制等等，而高特异性Taq酶的出现大大减少了摸条件这一繁琐的实验过程，也为PCR产物快速有效的纯化（PCR产物直接纯化）打下了基础。这类酶最典型的代表是热启动Taq酶。大家都知道，在PCR第一个循环变性之前，有一个升温的过程，引物和模板会有一些非特异性配对，如果这时Taq酶发挥活性，就很容易产生非特异性扩增，由于循环初期模板量非常少，产生的非特异性条带经过后面的指数扩增，就会严重干扰
4、目的片段的扩增，甚至导致特异性条带不能扩出。而热启动Taq酶是必需经过高温才能激活的酶，因此在初始循环的变性之前它没有活性，不会产生非特异性扩增，这就大大提高了PCR扩增的特异性。第一代热启动Taq酶往往直接在Taq酶上做一些修饰，比如用抗体抑制，蜡封等，如Clontech、Stratagen、Gibcol-LTI的一些产品，由于抗体、蜡等异物的掺入，对实验造成一定的影响，也给试验者带来一些不便。新一代的热启动Taq酶是通过内部改造的重组酶，真正实现便利的热启动，代表产品如QIAGEN公司的HotStar系列，无需别的辅助抑制物，也不用担心抑制不稳定，使用起来方便、高效。此外，由于几乎所有的T
5、aq酶产品都带有相应的反应缓冲液，缓冲液的品质也对保证Taq酶特异性扩增起着不可忽视的作用，一般的缓冲液中调节H键作用的盐只有KCl，QIAGEN公司的缓冲体系通过KCl、(NH4)SO4盐离子体系的平衡调节也提高了酶作用的特异性。 此外，热启动的Taq酶也是实现一步法RT-PCR的基础。如QIAGEN公司的OneStep RT-PCR试剂盒，在RT反应较低温度下，Taq酶没有活性，逆转录酶发挥活性；RT反应结束，高温灭活逆转录酶的同时，激活Taq酶，进行PCR反应。另一家公司Epicentre有一种MasterAmpTM Tth DNA聚合酶，本身就具有逆转录酶活性，也可用作RT-PCR。高
6、保真Taq酶 下游应用为基因筛选、测序、突变检测，分子诊断等等的用户，往往对PCR保真性要求很高，保真性的一个通用标准是错配率，错配率越低保真性越好。普通Taq酶的错配率在2-5X10-5碱基/循环数，而高保真Taq酶错配率可达10-6数量级，大大降低了出错的可能。其原理主要是因为高保真Taq酶具有3到5核酸外切酶（Proofreading）的活性，扩增途中如果产生了错配的碱基，它可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性。需要提醒用户的是由于此酶具有核酸外切酶功能，往往扩增效率低一些，有的还容易降解引物，且产物一般不宜用TA或UA克隆法克隆。目前市面上主要有两类产品，一类是混合型的高保真酶，将带有
7、Proofreading活性的酶与普通Taq酶（用于提高扩增效率）混合起来，错配率在8-9 X10-6碱基/循环数。Clontech、LTI等公司都有此类产品。如果要求更高的保真度，就要选择单一型的高保真酶，如Stratagene的Pfu，NEB公司的Vent DNA 聚合酶，错配率5.7 X10-5碱基/循环数；QIAGEN公司新推出的ProofStart DNA聚合酶，兼特异性与保真性于一体，其聚合酶及Proofreading活性都为热启动，可避免引物降解，错配率达2-410-6碱基/循环数，加上优化的反应体系，可在室温下配置反应液，可进行复杂模板（高GC含量、二级结构）及长片段的扩增，的
8、确是这类酶中的佼佼者。高耐热性Taq酶 对于有些模板变性温度较高，需要时间较长的用户，可能要求高耐热性Taq酶，这里介绍NEB公司的Vent和Deep Vent DNA聚合酶系列，两者都是从海底火山口分离出来后克隆的，是普通Taq酶耐热性的三倍以上，前者在95半衰期近7小时，100近2小时；后者更甚，分别为23小时和8小时。超长片段扩增Taq酶 对于作基因组图谱、测序及分子遗传学研究的用户，可能会用到超长片段的扩增，Clontech公司的Advantage Genomic系列混有Tth DNA聚合酶，Proofreading酶和热启动抗体，对复杂模板可扩增10kb片段，简单模板可达40kb。关
9、于复杂模板的扩增 对于模板结构复杂，如GC含量高（60%），有二级结构等，普通的Taq酶可能难以延伸下去，加入DMSO等助熔剂可帮助扩增顺利进行，但DMSO有毒，而且用量需要优化。QIAGEN公司的任何一种Taq酶都附有特制的Q-溶液，操作方便、安全，对复杂模板的扩增特别有效。关于条件的优化 现下很多著名的生物试剂公司都提供优化的缓冲液，如QIAGEN公司的缓冲体系，对温度和Mg2+的耐受性很强，随试剂盒有推荐的操作手册，大大减少了反应条件的优化，如果结合好的引物设计软件和高质量的模板引物，一次成功率极高。但任何东西都不是万能的，如果碰到比较特殊的情况，还需要仔细分析，优化调整。 以上就Taq
10、酶的一些基本分类分别进行了介绍，具体选购时要根据实验需要择其重点，再参照其他参数，才能选到最合适的Taq酶。我们会及时将最新的技术和产品推荐给大家，希望能帮助大家更快更好的达到实验目的。四.模板浓度过低。五、.退火温度过高。有可能，可以做个梯度PCR试一下。六、循环次数过少或延伸时间过短以致目的基因扩增量不够。这个可能性不大。七、dNTP浓度 低时PCR产率及特异性均增高，适合于用扩增掺入法标记生物素及放射性元素。当100l PCR液中含dNTP各40mol/L时就足以合成2.6g的DNA（dNTP消耗一半）,所以,你不小心多加了4倍的量,会很影响PCR结果,即Taq酶活力要降低2030%，即
11、底物抑制。八、PCR产物电泳1.电泳图不清晰，可能电泳缓冲液和制胶缓冲液浓度不准或者脏了吧。换新的电泳缓冲液和制胶缓冲液试试。marker都出问题说明是你的胶的问题，或者电泳操作的问题。 2. PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。如下图：其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。 3.如何获得亮的电泳条带 PCR反应前5个循环可以降低退火温度5，后面30-35个循环恢复正常退火温度。也可以以第一次PCR的产物作为二次P
12、CR的模板。DNA测序常见问题分析及解决办法总结常见问题具体情况可能的原因处理办法备注样品准备问题菌培养不好或失败抗性不对或菌已死核对抗性，尽可能提供载体信息。或菌培养条件特殊重新提供菌液，或提供2ug纯化质粒。质粒提不出质粒拷贝数极低或客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒。培养方式不当质粒产量很低低拷贝数质粒或客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒。培养方式不当自带质粒或已纯化PCR产物量极低是否为电泳法定量，质粒：电泳检测浓度大于100ng/ul，体积大于20ul。测OD值法不可靠,电泳检测总量是否足够已纯化PCR产物：根据片段长度提供足够量的模板，一般要求是100ng/反应
13、/Kb，进行多个反应的应相应增加量。测序出现双峰或信号中断双峰重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复用反向引物测互补链。此类问题主要与样品有关质粒测序在插入序列中出现套峰可能是样品非单克隆，挑其他克隆测序。PCR产物测序中，某一点后序列变乱可能是存在移码突变，这是正常的，也可以克隆后测序。PCR产物中一个或多个位置有套峰序列中存在突变，这是正常的，也可以克隆后进行测序。PCR产物测序前部分双峰引物二聚体污染或产物不纯，克隆后测序。质粒测序时整个结果双峰引物特异性不好，序列中存在通用引物的同源序列；改用其他引物测序。质粒和PCR产物测序出现双峰引物不纯，测序时只要单一引物，请不要将双向
14、PCR引物混合；合成的引物没有纯化，或纯化不好。重新合成引物测序。信号迅速衰减或中断模板GC二级结构区后难以得到好的测序结果，亚克隆成较小的片段进行测序模板GT二级结构区后测反向互补序列，AC结构不影响测序严重的重复结构测反向互补序列模板特性决定的根据具体情况决定信号极弱或无信号模板质量差重新提供菌液或纯化PCR产物质粒样品：引物不符尽量提供载体详细信息，核查引物引物不适宜测序测序引物比PCR引物要求高，随机引物和简并引物不能用于测序，较长的PCR引物也不能用于测序。重新设计引物测序，对PCR产物而言建议克隆到载体上用通用引物进行测序质粒产量极低客户自己提供2ug纯化好的质粒PCR产物定量极低
15、重新电泳检测已纯化的PCR产物，确认有足够的量，或提供PCR原液由公司进行纯化测序结果正常，与预期不符找不到引物质粒模板检测是否为空载体，从其互补链上寻找，克隆位点离测序引物太近，长插入片段未测通。PCR模板不可能找到所用的测序引物，短片段可以从互补链上找到另一段的引物，长片段由于测不通，无法找到相应序列想得到全序列，短片段可以从两端进行测序，长片段需要经克隆后进行测序。结果完全不对请提供详细资料我们会根据结果具体分析。测序常见问题分析序列中出现N值的常见原因：通常有以下几种情况将造成测序结果中N值较多：PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。通常我们很容易辨别PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿色峰），这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们用T载体克隆PCR产物就是根据该原理的。在最后一个碱基A后，信号会迅速减弱。因此我们要根据序列正确判断出PCR产物的末端序
