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1、真菌菌悬液的制备1）白色念珠菌悬液的制备1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于管中， 轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.0 ml10.0ml沙堡液体培养基试管，滴入少许菌 种悬液，置37C培养18h24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于沙堡琼脂 培养基平板上，于37C培养18h24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于沙堡 琼脂斜面，于37C培养18h24h,即为第3代培养物。2）取第3代14代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h24h），用5.0 ml吸管 吸取3.0 ml5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0m
2、l吸管 将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲80次，以使白色念 珠菌菌悬浮均匀。3）菌悬液的含菌量和菌片制备按2.1.1.2要求进行。4）菌悬液保存在4C冰箱内备用。当天使用不得过夜。5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。菌落形态可直 接用显微镜观察。菌体形态可在涂片后直接用高倍显微镜观察，也可用墨水阴地法染色（将 菌与黑墨水在玻片上混匀，推成薄膜）后观察。（2）黑曲霉ATCC 16404悬液或菌片的制备。1）在无菌操作下打开冻干菌种管，以毛细管吸取少量麦芽浸膏营养肉汤培养基加到菌 种管中，轻轻吹吸，使菌种沉淀物融化分散。取少许沉淀物悬液加
3、到含5.0ml麦芽浸膏营 养肉汤培养基试管中，置30C1C培养42h48h。用接种环划线接种第1代培养物 于MEA培养基平板，置30C1C培养箱中培养42h48h。取平板培养物中的典型菌落， 接种于麦芽浸膏营养肉汤培养基，置30C1C培养箱中培养42h48h，即为第3代培养 物。2）用10.0ml吸管吸取5.0 ml10.0ml第3代培养物，接种罗氏瓶，并摇动使菌液 布满MEA培养基表面，然后将多余肉汤培养物液体吸出，置30C1C培养42h48h。3）向罗氏瓶培养物中加入5.0 ml10.0ml 0.05% （V/V）吐温80生理盐水溶液，刮 洗黑曲霉分生抱子于溶液中，将抱子悬液移入装有玻璃珠
4、的三角瓶中，轻轻振摇1min后， 滤过除去菌丝。滤过后，显微镜下（400倍）观察是否存在菌丝，若悬液中有菌丝存在，可 经5000 r/min6000 r/min，离心20min。再次在显微镜下（400倍）观察，若悬液中仍 有菌丝存在，须再离心。4）黑曲霉分生抱子悬液在2C8C储存不能超过2 d,使用前，混合均匀，在显微 镜下（400倍）观察是否有抱子出芽，若有抱子出芽，则弃之不用。5）使用时，可用稀释液适当稀释。6）制备染菌样片时染菌方法为滴染法，每片加菌悬液10“ l。染菌后，置37C培养箱 内烤干（约30min），或置室温下自然阴干后再使用。7）回收菌数应达5X105cfu/片5X10飞c
5、fu/片，可依试验要求确定。生孢梭菌菌悬液制备其实无菌方法验证中的菌悬液的制备也是依中国药典（2005 年版二部）附录 XI H 无菌检查 法中“培养基灵敏度检查”项下的方法，制备成小于100 CFU/ml的对照用菌液。所以无论 你做什么，菌悬液的制备方法都是一样的。具体方法就是，先把生孢梭菌在硫乙醇中培养24小时，然后吸取1毫升培养液用生理盐水 进行10倍稀释，我的经验是，稀释到10的-7次方就是在100cfu以下了（这个你得自己多 做几次平行实验或验证实验，看到底稀释到多少倍。最初不好把握的时候可以同时培养几个 临近的梯度），然后取至少200ml的硫乙醇酸盐培养基到试管里（要求无菌），然后接种1ml 制备好的菌悬液到硫乙醇试管里，在32.5度下培养18h，然后开始计数。生孢梭菌在液体的硫乙醇里会长成梭子一样的单个菌落，这时拿的时候千万不要震动，然后 开始计数（一个单独的“梭子”计一个菌落）。注：如果培养时间太长会产生浑浊，不便于计数。如果震动试管也会浑浊。硫乙醇的量尽 量大一点，这样便于计数。
