动植物细胞培养

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1、动植物细胞培养动植物细胞培养是指动、植物细胞在体外条件下的存活或生长。动植物细胞培养与微生物细胞培养有很大 的不同（表 14-1）。由于动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固体或半固体的表面才能生长； 对营养要求严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血清。动物细胞对环境敏感，包 括pH值、溶氧、C02、温度、剪切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测和控制。相比之下， 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但植物细胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养产物 而且植物细胞生长较微生物要缓慢，因此长时间的培养对无菌条件及反应器的设计具有特殊的要求。 在生物技术中，

2、人们已经利用细菌、丝状真菌的大量培养来生产各种酶、抗生素、蛋白质、氨基酸等产物， 但是很多有重要价值的生物物质，如毒素、疫苗、干扰素、单克隆抗体、色素、香味物质等，必须借助于 动、植物细胞的大规模培养来获得。从20世纪50年代以来，这方面已取得一些进展。但是，目前的技术 还远不能满足细胞生物产品应用的要求，随着动植物培养技术研究的深入，显示出广阔的发展前景。表 14-1 动植物、微生物细胞的培养特征比较项目种类微生物动物细胞植物细胞大小110p m10100p m10100p m悬浮生长可以多数细胞需附着表面可以，但易结团，无才能生长单个细胞营养要求简单非常复杂较复杂生长速率快，倍增时间0.5

3、5小慢，倍增时间15100慢，倍增时间2474时小时小时代谢调节内部内部、激素内部、激素环境敏感不敏感非常敏感能忍受广泛范围细胞分化无有有剪切应力敏感低非常高高传统变异，筛选技术广泛使用不常使用有时使用细胞或产物浓度较咼低低第一节 动物细胞大规模培养技术动物细胞体外培养的历史可追溯到1907年，美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基成功 地在试管中培养了蛙胚神经组织达数周，创立了体外组织培养法。 1962年，其规模开始扩大，随着细胞生 物学、培养系统及培养方法等领域的不断丰富和完善，动物细胞培养技术得到了很大的发展。发展至今已 成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，

4、利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长 因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。其发展简史见表14-2。利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50%。大量资料表明，生物技 术药物是当前新药开发的重要领域，生物技术制药工业是下一个10年制药工业的重要新门类，期间将有数 百种生物技术新药上市。美国最新预测几种畅销基因工程药物2000年全球销售额EP 0大于30亿美元,G2CSF 大于20亿美元,HGH、IFN、UK均大于10亿美元，胰岛素和降钙素大于5亿美元。动物细胞大规模培养技术是 生物技术制药中非常重要的环节。目前,动物细胞大规模培养技术水平

5、的提高主要集中在培养规模的进一 步扩大、优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量上。表14 2动物细胞培养技术的发展年份技术发展概要1907年Harrison创立体外组织培养法。1951 年Earle等开发了能促进动物细胞体外培养的培养基。1957年Graff用灌注培养法创造了悬浮细胞培养史上绝无仅有的1X10! 02X 101。cells/L的记录，标志着现代灌注概念的诞生。1962年Caps tile成功地大规模悬浮培养小鼠肾细胞(BHK)，标志着动物细胞大规模培养 技术的起步。1967年1975年Van Wezel用DEAE Sephadex A 50为载体培养动物细胞

6、获得成功。Sato等在培养基中用激素代替血清使垂体细胞株GH3在无血清介质中生长获得成 功，预示着无血清培养技术的诱人前景。1975年Kobhler和Mils tein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预 定单克隆抗体的杂交瘤细胞。1986年1989DemoBio tech公司首次用微囊化技术大规模培养杂父瘤细胞生产单抗获得成功。 Konstantinovti首次提出大规模细胞培养过程中的生理状态控制，更新了传统细 胞培养工艺中优化控制之理论一、动物细胞形态(1) 成纤维细胞型(fibrlblast或mechanocyte type)这种细胞形态与体内成纤维细胞形态相似故而得

7、名。 细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有圆形核，胞质向外伸出23个长短不同的突起。细胞群常借原生 质突连接成网，生长时呈放射状、漩涡或火焰状走行如图14-l(a)。除真正的纤维细胞外，凡由中胚层 间充质来源的其他组织细胞，如血管内皮、心肌、平滑肌、成骨细胞等，也多呈成纤维细胞形态。实际上 很多所谓成纤维细胞并无产生纤维的能力，只是一种习惯上概括的称法。(2) 上皮细胞型(epithilium cell type)这种细胞呈扁平的不规则三角形，中央有圆形核，生长时常彼 此紧密连接单层细胞片如图14-1(b)，起源于外胚层和内胚层组织的细胞，如皮肤表皮及衍生物(汗腺、 皮脂腺等)。肠管上皮、肝、胰

8、和肺泡上皮细胞。培养时皆呈上皮型。(3) 游走细胞型(wondering cell t ype)这种细胞的培养需要在支持物上生长，一般不连接成片，细胞胞 质经常出现伪足或突起，呈活跃的游走和变形运动，速度快而且方向不规则如图14-1(c)。此型细胞不 很稳定，有时亦难和其他型细胞相区别，在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能变为成纤 维细胞型。(4) 多形性细胞型(polymorphic cell type)除上述三种细胞外，还有一些组织和细胞，如神经组织的细 胞等，难以确定它们的稳定形态，可统归多形性细胞如图 14-1(d)。上述这四种细胞形态均属于贴壁依赖型细胞，培养这类细胞时，

9、常需贴附在支持物上生长。但由于培养环 境的变化，细胞形态常发生改变。(5) 悬浮型细胞这类细胞常呈圆形，不贴附在支持物上，呈现悬浮状态生长。如血液细胞，淋巴组织细胞 及肿瘤细胞。培养这类细胞也可采用微生物培养的方法进行悬浮物培养。二、动物细胞培养基组成及制备1、培养基的组成动物细胞培养的培养基分为天然培养基和合成培养基两大类。天然培养基使用最早，营养成分高，也最为 有效。但成分复杂，个体差异大，来源也缺乏，因而使用受到限制。动物血清是细胞培养中用量最大的天 然培养基，血清含有丰富的营养物质，包括大分子蛋白质和核酸等，对动物细胞的生长繁殖具有促进作用。同时，血清对细胞贴壁和保护亦有明显作用，且能

10、中和有毒物质的毒性，使细胞不受伤害。图 14-1 动物细胞形态(a)成纤维细胞型；(b)上皮细胞型；(c)游走细胞型；(d)多形性细胞型合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成的，具有一定的组成。但这种模拟不是被动和 不加选择的，而是在体外反复实验和筛选、进行强化和重新组合后形成的人工合成培养基。这种培养基在 很多方面有天然培养基无法相比的优点。它给细胞提供了一个近似体内生存环境，又便于控制和标准化的 体外生存环境。目前所有细胞培养室都己采用经标准化生产、组份和含量都相对固定的各种合成培养基， 如 Eagle 基本培养基和更复杂的 NCTC109，TC199，HEM， DME，RP

11、MI1640，McCoy5A，HAMF12 等。尽管现代 的合成培养基成份和含量已经较为复杂，但仍然不能完全满足体外培养细胞生长的需要。在合成培养基中 都或多或少的要加入定比例的灭然培养基加以补充。目前多采用胎牛血清、小牛血清、马血清等，比例 从百分之几到百分之几十不等，要根据需要而定。其他各种天然培养基也可根据需要加入。 合成培养基的种类虽多，但一般都含有氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和一些其它辅助性成分。(1) 氨基酸 必需氨基酸是动物细胞本身不能合成的，因此，在制备培养基时需加入必需氨基酸，另外还 需要半胱氨酸和酪氨酸。而且由于细胞系不同，对各种氨基酸的需要也不同。有时也加入其他非必

12、需氨基 酸，氨基酸浓度常常限制可得到的最大细胞密度，其平衡可影响细胞存活的生长速率。在细胞培养中，大 多数细胞需要谷氨酰胺作为能源和碳源。(2) 维生素Eagle基本培养基中只含B族维生素，其他维生素都靠从血清中取得。血清浓度降低时，对其 他维生素的需求更加明显，但也有些情况，即使血清存在，它们也必不可少。维生素限制可从细胞存活和 生长速率看出，而不是以最大细胞密度为指标。(3) 碳水化合物 碳水化合物是细胞生命的能量来源，有的是合成蛋白质和核酸的成分，主要有葡萄糖、 核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸钠等。(4) 无机盐 无机盐是细胞的重要组成部分之一，它们积极参与细胞的代谢活动。无机盐中 Na

13、+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO 2-、PO 3-和 HCO-等金属离子及酸根离子是决定培养基渗透压的主要成分。对悬浮培养，要减443少钙，可使细胞聚集和贴壁最少，碳酸氢钠浓度与气相co2浓度有关。(5) 有机添加剂 复杂培养基都含有核苷、柠檬酸循环中间体、丙酮酸、脂类、氧化还原剂如抗坏血酸、 谷胱甘肽等及其他各种化合物。同样，当血清量减少时，必须添加这种化合物，它们对克隆和维持这些特 殊细胞有益。(6) 血清 组织细胞培养中常用的天然培养基是血清。这是因为血清中含有大量的蛋白质、核酸、激素等 丰富的营养物质，对促进细胞生长繁殖，粘附及中和某些物质的毒性起着一定的作用。最常用的是小牛

14、血 清，胎牛血清。人血清用于一些人细胞系。大多数动物细胞培养必须在培养基中添加血清，但在许多情况 下，细胞可在无血清条件下维持和增殖。目前合成培养基的配方都已相对固定，并形成配制好的干粉型商品。其成分趋于简单化，以能维持细胞生 长的最低需求，而去除了不必要的成份。同时为适应某些特殊培养的需要补加些新的成分，如培养杂交 瘤细胞时采用DMEM培养基需补加丙酮酸钠和2-硫基乙醇；为增加细胞转化和DNA合成，有时补加植物血 凝素(PHA )等。这些变化需根据实验和细胞的具体要求而定。2、培养基制备以及制备过程中应考虑的因素虽然各种培养基的组成各有不同、但形成商品化的干粉型培养基的配制方法却大同小异。绝

15、大多数合成培 养基的生产都己标准化、商品化。较为常用的培养基市场上很容易购得。这种干粉型培养基性质稳定，便 于储存、运输、价格便宜，给使用和配制合成培养基带来很大方便。一般的特殊需求也多可在现有合成培 养基基础上补加或调整某些成份予以满足。以往实验室自购各个组份，称量后再按一定顺序进行溶解配制 的老方法，一方面需购置大量各种各样的成份，而且每种成份用量很少，很难控制和统一；另一方面要精 确称量，顺序溶解，步骤繁琐，质量难以保证。除了因特殊需要而专门配制一些特殊培养基外，大部分已 不再使用。在制备培养基时，通常要考虑以下因素：(1) pH值 多数细胞系在pH=7.4下生长得很好。尽管各细胞株之间细胞生长最佳pH值变化很小，但一些 正常的成纤维细胞系以pH=7.47.7最好，转化细胞以pH=7.07.4更合适。据报道，上皮细胞以pH=5.5 合适。为确定最佳pH值，最好做一个简单的生长实验或特殊功能分析。酚红常用作指示剂，pH=7.4呈红色，pH=7.0变橙色，pH=6.5变黄色，而pH=7.6呈红色中略带蓝色，pH=7.8 呈紫色。由于对颜色的观察有很大的主观性，因而必须用无菌平衡盐溶液和同样浓度的酚红配一套标准样， 放在与制备培养基相同