色氨酸与TCBQ荧光性质的测定2

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1、L-色氨酸与四氯苯醌（TCBQ）荷移荧光光谱法的研究摘 要 本文使用荧光光谱法研究了 L-色氨酸与四氯苯醌（TCBQ ）的荷移反应。通过实验可得知， L-色氨酸与TCBQ在水中，以pH=10.9溶液，活性剂为代十六烷基毗啶溶液，在20C的室温下加热 10min以后，可生成稳定的荷移络合物。此荷移络合物的最大激发波长 入=284，最大发射波长入 max=364， F =0.32857+25.48571 c （卩g/mL ） （R=0.99902）,浓度在 02.0 n g/mL 的范围内符合比尔定 max律，回收率在98.59103.4%之内，相对标准偏差在0.96%以内，该方法最低检测限为0.

2、037卩g/mL。 关键词荧光猝灭法 L-色氨酸四氯苯醌（TCBQ ）荷移反应1 引言L-色氨酸（L-trytophan）是人类和动物必需的八种氨基酸之一，化学名称为L-氨基吲哚基丙酸，别名L-胰化蛋白氨基酸、L-B - （3-吲哚基）-a -丙氨酸，它是含有吲哚基的芳香族氨基酸， 呈白色或略带黄色的叶片状结晶或粉末，无臭有甜味，溶于热吡啶，微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙 醚，在稀酸或稀碱中溶解。L-色氨酸有促进机体生长发育，修补组织细胞的作用；有为肌体提供营 养的作用；对肌体内各种酶、激素的分泌起调节的作用；提高肌体的免疫抵抗能力的作用；运输其 它营养物质和解毒的作用。L-色氨酸系氨基酸类药物，

3、对抑郁症、失眠症、高血压、及止痛等有良 效，在欧美一些国家已广泛应用于临床 1。目前定量测定L-色氨酸的方法主要有高效液相色谱法2-4、电位滴定法5、原子吸收光谱法6、 荧光光谱法7,8、分光光度法9-11、毛细管电泳分析法12、阻抑速差催化光度法13、线扫伏安法14、 化学发光法15-17等。利用与四氯苯醌（TCBQ）发生荷移反应测定L-色氨酸含量的方法还未见报道。本文选用TCBQ 为电子接受体，研究了 L-色氨酸与TCBQ形成荷移络合物的条件，探讨了反应机理，并对药物样品 进行了含量测定，结果令人满意。2 实验部分2.1 主要仪器与试剂仪器 LS55 发光分光光度计（美国 PE 公司）；

4、WGY-10 型荧光分光光度计（天津市港东科技发展 有限公司）； HH-6 电热恒温水浴锅（北京科伟永鑫实验仪器厂）； 92M-202A-DR 电子天平（普利赛斯 国际贸易上海有限公司）； 211 型酸度计（意大利 Hanna） ,XYJ-802 离心沉淀机（江苏医疗仪器 厂）。试剂L-色氨酸（天津市大茂化学仪器供应站），TCBQ （sigma-Aldrich），溴代十六烷基吡啶（天 津市光复精细化工研究所）。所用试剂中溴代十六烷基吡啶为化学纯， 其余均为分析纯，实验用水为 超纯水。2.2 溶液的配制方法L-色氨酸溶液的配制：准确称取0.25000gL-色氨酸，用水溶解，转移到250mL的容量

5、瓶中，用 水稀释至刻度，摇匀，配成lg/L的溶液。准确量取1ml lg/L的L-色氨酸，用水溶解，转移到lOOmL 的容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，配成 0.01g/L 的溶液。pH=10.9 的三酸缓冲溶液：分别取 2.70mL 磷酸、2. 29mL 冰醋酸、2. 47g 硼酸于 1000mL 容量瓶 中并稀释至刻度，在酸度计下，用 0.2mol/L 的氢氧化钠调节至 pH=10.9。TCBQ溶液的配制：准确称取0.25000g TCBQ，用少量的乙醇溶解，转移到250mL的容量瓶中， 用乙醇稀释至刻度，摇匀，配成 1g/L 的溶液。硼砂溶液的配制：准确称取 38.14g 四硼酸钠，用水溶

6、解，转移到 1000mL 的容量瓶中，用水稀 释至刻度，摇匀，配成 0.1mol/L 的溶液。溴代十六烷基吡啶溶液的配制： 准确量取 5mL 的溴代十六烷基吡啶于烧杯中， 用 500mL 水溶解， 配成 0.1mol/L 的溶液，摇匀后，置于试剂瓶中备用。样品的制备：血清 1.0mL 于 10mL 离心试管中，加 3.0mL 乙醇除蛋白,静置 5min4000r/min 离心 10min, 取上清夜于比色管中。2.3 实验方法准确移取适量O.Olg/L的L-色氨酸溶液分别于两支10mL比色管中，其中一支依次加入表面活 性剂溴代十六烷基吡啶溶液0.7mL，用pH=10.9的三酸缓冲溶液稀释至刻度

7、，另一支依次加入TCBQ 乙醇溶液0.3mL、表面活性剂溴代十六烷基吡啶溶液0.7mL，并用pH=10.9的三酸缓冲溶液稀释至刻 度，摇匀，在室温下反应10min后，在负高压140，出射狭缝4nm，扫描间隔2min的条件下，用1cm 石英比色皿，在284nm激发波长处，测定364nm处的发射荧光强度F和F并计算荧光猝灭量 F二 F F 。123 结果与讨论3.1 实验条件的选择3.1.1 吸收光谱按照实验方法，用荧光分光光度计对水， TCBQ 的乙醇溶液，色氨酸溶液，色氨酸 -TCBQ 溶液进 行激发和发射光谱扫描，负高压为140，光谱通带均为4nm。在220nm800nm之间扫描。结果（图

8、1、 2）表明，水中 TCBQ 的激发值和荧光值都很低，对测定无干扰，色氨酸溶液的激发峰和发射峰分 别为284 nm和364 nm；加入TCBQ，峰高明显下降，而峰形和峰位都没有发生显著的变化。实验选 择的激发波长为284 nm，发射波长为364nm。30. 0o60荧光强度图 1 不同浓度下的发射光谱谱图 注释：从上至下谱线 110分别如下：1 -色氨酸（2.0mL）, 2 -色氨酸（l.OmL）, 3 -色氨酸（2.0mL）- -TCBQ,5 -色氨酸（0.5mL）, 6 -色氨酸（0.2mL）, 7 -色氨酸（0.5mL）8 -色氨酸（0.2mL） - TCBQ, 9 -色氨酸（O.lm

9、L）, 10 -色氨酸TCBQ, 4 -色氨酸（l.OmL）-TCBQ,（O.lmL） - TCBQ荧光强度100. o軸80. 0-uo6卜卜渡长run）图 2 不同浓度下的激发光谱谱图 注释：从上至下谱线 110 分别如下：1 -色氨酸（2.0mL）, 2 -色氨酸（l.OmL）, 3 -色氨酸（2.0mL）-TCBQ,TCBQ, 4 -色氨酸（l.OmL）-TCBQ,5 -色氨酸（0.5mL）, 6 -色氨酸（0.2mL）, 7 -色氨酸（0.5mL）8 -色氨酸（0.2mL） - TCBQ, 9 -色氨酸（O.lmL）, 10 -色氨酸（O.lmL） - TCBQ3.1.2 溶剂的影响

10、 选用不同的溶剂按实验方法配制溶液，测定相应络合物的激发强度和发射强度并计算其猝灭量，结果（表 1）表明，在乙醚、乙醇、乙腈、丙酮、二甲亚砜中试剂均有沉淀或分层现象，结果（表 2） 表明，溶剂用水和甲醇所得的结果差不多， 但因考虑到甲醇有毒成本较贵， 则本实验采用水为溶剂。表 1 溶剂的影响溶剂乙醚乙醇乙腈甲醇水丙酮二 甲 亚飒现象分层淡粉沉乳黄沉溶液溶液白色沉乳黄沉淀淀淀淀表2溶剂的影响溶剂L-色氨酸发射L-色氨酸与TCBQ发射F甲醇44.925.719.2水33.118.914.22 L-色氨酸的荧光强度；4一L-色氨酸与TCBQ荧光强度;3.1.3 温度和时间的影响 按实验方法进行，测定

11、不同温度下不同反应时间的猝灭量及发射峰位，结果（表 3、4、5）表明，从表 3、4、5 中可看出，选取在室温，反应时间10min 的条件下，发射的强度大且猝灭量较大且稳定。表3温度（19.8C）和时间的影响时间(min)1(nm)23(nm)4F0358.033.2360.023.79.55360.033.3358.023.69.710358.033.1358.023.29.915358.032.8358.023.09.820358.032.7358.023.09.725358.032.3360.022.69.730358.031.9360.022.49.535358.032.1358.022

12、.29.940358.032.5358.021.610.945360.032.2358.021.810.450360.032.8358/021.611.255358.032.9360.021.711.260360.033.0360.021.711.370358.033.2360.021.511.780358.033.5358.021.512.090358.032.9358.021.111.8100358.032.2358.021.111.1注释：1 一L-色氨酸的发射峰位；3L-色氨酸与TCBQ发射峰位;表4温度（30 C）和时间的影响时间(min)1(nm)23(nm)4F0358.029.

13、9358.025.44.55360.027.4358.022.05.410360.025.8360.020.35.515358.025.8360.019.86.020360.026.0360.019.36.725358.026.3360.018.77.630360.025.8360.019.06.835360.025.9360.018.17.840360.025.6360.018.07.645360.025.8360.017.78.150358.025.2358.017.67.655358.025.7360.017.68.160358.025.9358.017.48.570360.025.8358.017.58.380358.025.6360.016.88.890358.025.6360.016.09.6100360.025.1360.016.28.9注释：1L-色氨酸的发射峰位；2 L-色氨酸的荧光强度；3L-色氨酸与TCBQ发射峰位；4 L-色氨酸与TCBQ荧光强度；表5温度（40C）和时间的影响时间(min)1(nm)23(nm)4F0360.033.1358.024.8&35360.026.3360.021.05.310360.024.4360.019.45.015358.024.0360.019.14.920358.024.8360.019.35.5