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1、氧化应激后大鼠神经元内 Nogo 【关键词】 神经元 【Abstract】 AIM: To investigate the change of NogoA expression in cerebral cortex neurons after oxidative stress and its possible functions. METHODS: Primarily cultured cerebral cortex neurons in rats were treated with H2O2 for 8 h and the morphology of neurons was observed
2、. Hoechst33342 and PI staining were performed to detect apoptosis and necrosis of neurons, and NogoA expression was detected by Western blot. RESULTS: We observed that soma of neurons condensed, rounded, even collapsed, and processes disrupted and shed after treatment with 10 mmol/L and 100 mmol/L H
3、2O2. Hoechst33342 and PI staining showed that, compared with that of control group, the percentage of apoptosis and necrosis did not increase after neurons were treated with 1 mmol/L H2O2, while it significantly increased after neurons were treated with 10 mmol/L and 100 mmol/L H2O2 (P<0.05). Wes
4、tern blot analysis showed that NogoA expression had no difference with that of control group after neurons were treated with 1 m mol/L H2O2, whereas was significantly higher than control group after neurons were treated with 10 mmol/L and 100 m mol/L H2O2 (P<0.05). CONCLUSION: Oxidative stress ma
5、y upregulate the expression of NogoA in neurons, and NogoA is 1presumed to be involved in the pathological processes of CNS degenerative diseases. 【Keywords 】 rat; neuron; oxidative stress; NogoA; Western blot 【摘要】 目的: 探讨大鼠大脑皮层神经元受到氧化应激后 NogoA 表达的变化及其可能的作用. 方法: 体外原代培养大鼠大脑皮 层神经元，给予不同浓度 H2O2 处理 8 h 后，
6、倒置相差显微镜下观察神 经元的形态学变化、Hoechst33342 和 PI 染色观察凋亡和坏死情况， 然后 Western blot 观察 NogoA 的表达变化. 结果: 大鼠皮层神经元受 到 10 和 100 mmol/L H2O2 刺激后，神经元出现胞体回缩、变圆甚至 崩解,突起断裂、脱落等细胞受损的现象；Hoechst33342 和 PI 染色观 察到 1 mmol/L H2O2 时神经元凋亡和坏死比例与对照组相比没有差 别，而 10 和 100 mmol/L H2O2 刺激后，神经元凋亡和坏死比例明显 增加（P<0.05） Western blot 结果显示， mmol/L
7、H2O2 时 NogoA .1的表达量与对照组相比无明显差异，而在 10 和 100 mmol/L 时 NogoA 的表达量明显升高（P<0.05）. 结论: 氧化应激可以上调神经元 NogoA 的表达. 【关键词】 大鼠；神经元；氧化应激；NogoA；Western blot 0 引言 氧化应激在许多中枢神经系统（CNS）疾病的发生发展中起重 要作用. 细胞受到氧化应激后基因表达发生改变，并伴随转录因子表 达的改变以适应环境变化1. 神经元经 H2O2 处理后，转录因子 Sp1 2（specificity protein 1） 水平迅速升高而且与 DNA 结合能力也升高. NogoA
8、是 CNS 损伤后最重要的轴突再生抑制因子. NogoA 在 CNS 中还具 有其他功能2. NogoA 5端上游区有 12 个可与 Sp1 结合的位点， 即 Sp1 可以调节 NogoA 的表达3. 我们体外培养大鼠大脑皮层神经 元， 给予 H2O2 刺激并观察 NogoA 的表达变化， 以期探讨神经元内 NogoA 可能参与的作用. 1 材料和方法 1.1 材料 DMEM, FBS, Neurobasal medium, B27 supplement, DHanks 平衡盐液购自 Gibco 公司；胰酶、多聚赖氨酸、EDTA, Hoechst33342 和 PI 购自 Sigma 公司；6
9、 孔、24 孔板购自 NUNC 公司；300 mL/L H2O2 分析纯购自西安化学试剂公司；NogoA 兔多克隆抗体由本室制备4 ；BM Chemiluminescence Western Blotting Kit 购 自 Boehringer Mannheim 公司. 新生 SD 大鼠由第四军医大学实验动物中心提供. 所 用的 6 孔、24 孔板和玻片预先经 100 mg/L 多聚赖氨酸硼酸盐缓冲液 37包被 4 h，三蒸水洗 3 遍晾干备用. 1.2 方法 新生 SD 大鼠经冷冻麻醉，碘酒乙醇消毒,无菌操作下，将头 剪下放入预冷的 DHanks 平衡盐液中. 在解剖显微镜下分离并取出大 脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约 1 mm1 mm1 mm 大小，加入胰酶 EDTA 消化液，37孵箱内消化 20 min，中间摇晃 1 次. 随后吸出组 织转移到装有预冷培养液（DMEM100 mL/L FBS）的离心管内，用巴 3
