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1、大肠杆菌的检测：大肠菌群测定的操作细则 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌 主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染 肠道致病菌的可能。食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。1 设备和材料1.1 温箱：361C。1.2 冰箱:04C。1.3 恒温水浴：44.50.5C。1.4 天平。1.5 显微镜。1.6均质器或乳钵。1.7平皿:直径为90mm。1.8试管。1.9吸管。1.10广 口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。1.11玻璃珠:直径约5mm。1.12载玻片。1.13酒精灯
2、。 1.14试管架。2 培养基和试剂2.1乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。2.2 伊红美蓝琼脂平板: 按 GB 4789.28 中 4.25 规定。2.3乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。2.4 EC 肉汤:按 GB 4789.28 中 4.11 规定。2.5 磷酸盐缓冲稀释液: 按 GB 4789.28 中 3.22 规定。2.6 生理盐水。2.7 革兰氏染色液: 按 GB 4789.28 中 2.2 规定。3.1 检样稀释3.1.1以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶 内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳
3、钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。 固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。3.1.2用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试 管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。3.1.3另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支 1mL 灭菌吸管。3.1.4根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度，接种3 管。3.2 乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管,1m
4、L及 1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置361C温箱内，培养242h, 如所有乳糖胆盐发酵管都不产气， 则可报告为大肠菌群阴性， 如有产气者， 则按下列程序进 行。3.3 分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置361C温箱内，培养18-24h，然后取 出， 观察菌落形态， 并做革兰氏染色和证实试验。3.4 证实试验 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置 361C温箱内培养242h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆 菌， 即可报告为大肠菌群阳性。3.5 报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查M
5、PN检索表，报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。4 粪大肠菌群(faecal coliform)4.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物（见 3.2 条）转种于 EC 肉汤管内,置44.50.2C水浴箱内（水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面），培养242h，经培养后,如所有 EC肉汤管均不产气，则可报告为阴性;如有产气者，则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊 红美蓝琼脂平板上, 置 培养 18-24h, 凡平板上有典型菌落者, 则证实为粪大肠菌群阳性。4.2 结果报告根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）粪大肠菌群的MPN值 乳酸菌的检测：一 概述
6、乳酸菌是指一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过 氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。这类细菌在自然界分布广泛，可栖居在人 和各种动物的口腔、肠道等器官内，在土壤、食品、饲料、水及一些临床标本中都有乳酸菌 的存在。乳酸菌在工业、农业和医药等与人类生活密切相关的领域应用价值很高，相当多的 乳酸菌对人、畜的健康起着有益的作用，但个别菌种能对人畜致病，乳酸菌主要包括23 个 属的细菌。二 样本采集 检样主要为含乳酸菌活菌的饮料和微生态制剂，样本应放入冰箱保存，心快检验。三 检验方法（中华人民共和国国家标准 乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验 GBT 16347-1996
7、）乳酸菌菌总数的测定：乳酸菌菌落总数是指标样在一定条件下培养后，所得1ml检样中所含 乳酸菌菌落的总数。（一）检验程序 乳酸菌菌落总数检验程序如下：（二）培养基和试剂改良TJA培养基（改良番茄汁琼脂培养基）；改良MC培养基（modified Chalmers 培养基）；0.1%亚甲蓝牛乳培养基；6.5%氯化钠肉汤参照；pH9.6葡萄糖肉汤；40%胆汁 肉汤；淀粉水解培养基；精氨酸水解培养基；乳酸杆菌糖发酵管；七叶苷培养基；革兰氏染 色液； 3%过氧化氢溶液；蛋白胨水、靛基质试剂；明胶培养基；硝酸盐培养基、硝酸盐试 剂；生理盐水：定量分装于三角瓶和试管内灭菌。（三）操作步骤1. 以无菌操作将经过
8、充分摇匀的检样25ml （或25g）放入含有225ml灭菌生理盐 水的来菌广口瓶内做成1： 10的均匀稀释液。2. 用1ml灭菌吸管吸取1： 10稀释液1m,沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水 的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）。3. 另取1ml灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍增稀释液，如此每递增一次，即 换用 1 支 1ml 灭菌吸管。4. 选择23个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀 释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。5稀释液移入平皿后，应及时将冷至50C的乳酸菌计数培养基（改良TJA或改良MC）注入平皿约15ml，并转动平皿使
9、混合均匀。同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1ml稀 释液检样用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照，以上整个操作自培养物加入培养皿开 始至接种结束须在20min内完成。6待琼脂凝固后，翻转平板，置36C1C温箱内培养72h3h取出，观察乳酸 菌菌特征，选取菌落数在30300之间的平板进行计数。计算后，随机挑取5个菌落数进行 革兰氏染色，显微镜检查并做过氧氢酶试验。革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，无芽胞的球菌 或杆菌可定为乳酸菌。根据证实为乳酸菌菌落计算出皿内的乳酸菌数，然后乘其稀释倍数即 得每亳升样品中乳酸菌数。例如，检样104的稀释液在改良TJA琼脂平板上，生成的可疑 菌落为35 个，取 5 个鉴
10、定，证实的乳酸菌的 4 个，则 1ml 检样中乳酸菌数为：35X4 / 5X104 = 2.8X1057.乳酸菌在改良TJA和改良MC培养基上菌落生长形态特征。(四) 乳酸菌的鉴定 对上述分离到的乳酸菌需进行菌种鉴定时，则作以下试验。1菌种制备 自平板上挑取菌落，接种于改良TJA或改良MC琼脂斜面，于36C 1C, 2448h培养，刮取菌苔，分别进行下列试验。2乳酸杆菌鉴定试验 极少见还原硝酸盐，不液化明胶，不产生靛基质和硫化氢。 3常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应。4产酸乳的链球菌的鉴别试验。Detectio n of Escherichia coli: Determ in ati on o
11、f coliform bacteria in the operati ng rulesColiform group refers to the group of ferme nt lactose, acid gas, aerobic and facultatively an aerobic gram-n egative non-spori ng bacillus.The bacteria mainly comes from huma n and an imal feces, therefore as the faecal polluti on in dicators to evaluate t
12、he hygie nic quality of food, food is not in fer polluti on in test inal pathoge ns may.The number of coliform bacteria in food by 100mL (g) samples in coliforms most probable number (MPN) said.1 the equipme nt and materials1.1: 36 1 C temperature box.1.2: 0 4 C refrigerator.1.3: 44.5 0.5 C constant
13、 temperature water bath .In 1.4 days.The 1.5 microscope.1.6 homoge ni zer or mortar.1.7 Petri dish: diameter of 90mm.1.8 tube.The 1.9 straw.1.10 jars or Erle nmeyer flask: capacity of 500mL.1.11 glass beads: diameter of about 5mm.1.12 slides.1.13 alcohol lamp.The 1.14 test tube rack.2 culture media
14、and reage nts2.1 bile salt lactose ferme ntati on tube: accord ing to GB 4789.28 4.9 provisi ons.Eos in methyle ne blue agar plate: 2.2 in GB 4789.28. 4.25 provisi ons.2.3 lactose ferme ntati on tube: accord ing to GB 4789.28 4.10 provisi ons.2.4 EC broth: according to GB 4789.28 4.11 provisions.2.5
15、 phosphate buffer solution at GB 4789.28: 3.22 set.2.6 sali ne.2.7 Gram sta ining soluti on: accord ing to GB 4789.28 2.2 provisi ons.3.1 sample diluti on3.1.1 to aseptic sample 25mL (or G) on the 225mL of sterile saline or other dilution liquid sterilizati on glass bottles (bottles to the appropria
16、te n umber of glass beads) or sterilizati on mortar, after full shak ing or gr inding to make 1:10 un iform diluti on. Solid sample with homoge ni zer, 8 000-10 000 r/min 1min 1:10 speed of process ing, made of un iform diluti on.3.1.2 1mL sterilizing straw to draw 1:10 dilution of 1mL, injected with 9mL of sterile saline or oth
