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1、浅论2糖蛋白I纯化及其稳定性分析【摘要】 目的： 从正常人混合血浆中纯化获得2糖蛋白，并对提纯蛋白的纯度及稳定性进行分析。方法： 采用HClO4沉淀、Heparin Sepharose CL6B亲和层析柱等纯化2GPI；利用SDSPAGE、蛋白质印迹分析提纯蛋白的纯度；观察不同温度、NaCl浓度及防腐剂等条件下的2GPI稳定性。结果： 本法获得了高纯度目的蛋白2GPI。 2GPI在浓度低于 mol/L 的NaCl溶液中，置室温及4保存易降解变性，但在 mol/L NaCl溶液中于室温及4保存60天均未见蛋白明显降解。结论： 利用本法能够得到高纯度的2GPI，在使用和保存2GPI时要考虑到其降解
2、的可能性，注意保存条件，必要时冻干保存。【关键词】 2糖蛋白I；蛋白纯化；蛋白稳定性Abstract Objective: To purify 2glycoprotein I(2GPI)from normal human plasma and analyze its purity and stability. Methods： 2GPI was purified by Heparin Sepharose CL6B affinity chromatography following by HClO4 precipitation. The purity of the isolated 2GPI w
3、as identified by SDSPAGE, Western Blot analysis. And its stability was observed under different temperature, concentration of salt and antiseptics. Results： 2GPI was harvested using above methods and its purity was confirmed more than 95%. The protein maintained in the concentration of lower thanmol
4、/L NaCl might be degraded at room temperature even though at 4. But it was obviously stable when it was maintained inmol/L NaCl at room temperature or 4. Conclusion： Human 2GPI with highpurity from the plasma can be obtained by our methods. It is important to protect 2GPI from denaturazation in the
5、process of conservation and regular use. It is the best way to dry the protein into powder for keeping 2GPI long time.Key words 2GPI； protein purification； protein stability2糖蛋白I(2glycoproein I, 2GPI)又称载脂蛋白H，是由326个氨基酸组成的相对分子质量约为50 kD的血浆单链糖蛋白，其结构由5个补体调控蛋白样结构区组成。在正常人血浆中， 2GPI 含量约为200 mg/L，其中60 %左右呈游离状
6、态。 2GPI与三酰甘油及肝素等具有高度的亲和作用，能激活脂蛋白脂酶，参与脂代谢等1。近年来， 2GPI及其抗体在抗磷脂综合征病理机制中的作用受到极大关注。研究发现， 2GPI是抗磷脂抗体的主要靶抗原，其抗体的产生在抗磷脂综合征的血栓形成中发挥着重要的作用2，3。然而， 2GPI及其抗体促血栓形成的具体机制还未完全阐明。本研究组近年来一直在进行这方面的探讨工作， 2GPI及其抗体是该研究工作的必备条件。因此，首先要纯化出2GPI蛋白，并分析其特性，为深入的机制研究奠定基础。1 材料与方法材 料 正常人混合血浆由镇江市中心血站提供。Heparin Sepharose CL6B亲和层析柱购自瑞典A
7、mersham Biosciences公司；蛋白标准参照物购自立陶宛Fermentas公司； 2GPI标准品购自美国USBio公司；抗2糖蛋白I单克隆抗体购自美国Chemicon公司；HRP标记的羊抗鼠二抗购自博士德生物工程有限公司；丙烯酰胺、双叉丙烯酰胺、SDS和APS均购自美国Amresco公司；CHEMIDOC XRS凝胶成像系统购自美国BIORED公司；其他试剂均为国产分析纯。方 法血浆标本处理 100 ml正常人混合血浆中加入 ml的2NaN3,然后加入 ml的70HClO4，4搅拌30 min, 10 000 r / min离心30 min，取上清，用Na2CO3调pH至，转移至透
8、析袋中用 mol/L TrisHCl /mol/L NaCl()的缓冲液4透析后备用。层析柱准备 称取Heparin Sepharose CL6B 1g溶胀于50 ml的 mol/L TrisHCl /mol/L NaCl()缓冲液中，弃去上层悬浮小颗粒。处理好的填料灌入玻璃层析柱后，用以上相同缓冲液洗涤平衡后备用。上样平衡 将上述处理过的样本小心加到Heparin Sepharose CL6B亲和层析柱床面上，待样品刚好渗入到柱中，用 mol/L Tris HCl /mol/L NaCl()平衡液洗脱至流出液D值达到基线，流速36 ml / h，收集上样平衡流出液。洗脱收集 用洗脱I液 mo
9、l/L Tris HCl /mol/L NaCl()和洗脱液 mol/L TrisHCl /mol/L NaCl()进行分步洗脱，流速36 ml / h，每1 ml收集样本,并检测每管D值。蛋白鉴定 SDSPAGE电泳鉴定。将S1,S2及各洗脱峰收集样本经12 %SDSPAGE电泳,观察各收集液蛋白条带，另加白蛋白(ALB)样本作为鉴别对照。在基本认为洗脱峰蛋白为目标蛋白后，将洗脱峰蛋白、 2GPI标准品及两者混合样本进行SDSPAGE电泳，进一步确定是否为目标条带以及是否有杂带。蛋白质印迹鉴定。分别取纯化蛋白、 2GPI标准品各2 g经SDSPAGE电泳后，转至PVDF膜上，用鼠抗人2GPI
10、单克隆抗体和HRP标记的羊抗鼠的二抗分别孵育后，ECL荧光显色，凝胶成像系统记录结果。蛋白稳定性分析 重点观察不同温度、盐浓度、防腐剂及酶抑制剂对纯化蛋白稳定性的影响。温度的影响：将蛋白置于室温, 4及-20下，存放20,40,60 d后，SDSPAGE观察蛋白条带有无变化。NaCl浓度的影响：观察蛋白在不同浓度NaCl中，随着存放时间的延长是否有变化。防腐剂及酶抑制剂的影响：分别观察蛋白在含有NaN3或PMSF的情况下，存放不同时间后有无变性、降解等。观察方法采用SDSPAGE电泳。2 结果蛋白纯化 正常人混合血浆经HClO4沉淀后获得的粗品为透明澄清的液体。调节粗品pH并透析后上样，平衡液
11、洗脱至流出液D值达到基线，共收集到55 ml平衡收集液，在随后的分步洗脱中，洗脱和洗脱各获得一个洗脱峰。 图1 HClO4沉淀后样品过Heparin SepharoseCL6B亲和层析柱分步洗脱收集峰Fig 1 Eluted peak of the supernatant of sera precipitatedby HClO4 passed through Heparin SepharoseCL6B affinity columnSDSPAGE结果 选择样本S1，S2,洗脱I峰的A，B，C， 洗脱峰a，b，c，d进行SDSPAGE电泳,结果见图2。粗纯品S1有3个条带，上方条带与白蛋白相近，
12、相对分子质量约66 kD,下方还有2个条带，相对分子质量分别约为50 kD，45 kD；上样平衡收集液S2出现的条带与S1基本一致；洗脱收集液中与肝素柱结合不强的白蛋白和其他一些杂带首先被洗脱下来；洗脱收集液中b，c，d相对分子质量相同，为肝素亲和蛋白，系同一种蛋白，CHEMIDOC XRS凝胶成像系统扫描该蛋白条带纯度高达95以上。进一步将洗脱收集的蛋白标本c 2 g， 2GPI标准品2 g及两者混合样本经过SDSPAGE电泳，结果表明条带位置一致，浓度一致，相对分子质量约为45 kD。 ALB：白蛋白； S1：HClO4沉淀后标本； S2：上样平衡流出液；A,B,C:图1洗脱峰I对应标本；
13、 a,b,c,d：图1洗脱峰对应标本图2 提纯各步骤收集液SDSPAGE电泳鉴定Fig 2 SDSPAGE analysis of the fractions collected duringdifferent steps of purificationM:蛋白标准参照物； 1： 2GPI标准品(2 g) ；2：标准品(2 g)+洗脱峰c标本(2 g)； 3：洗脱峰c标本(2 g)图3 纯化蛋白的SDSPAGE(12%)电泳鉴定Fig 3 Identification of purified protein on 12%SDSPAGE蛋白质印迹结果 应用单克隆抗人2GPI抗体对提纯蛋白进行蛋白
14、质印迹，以2GPI标准品作为阳性参照。结果出现与2GPI标准品相同的阳性反应条带，并且阳性带浓度一致。 S： 2GPI标准品(2 g)； 1：洗脱峰c标本(2 g)图4 蛋白质印迹分析图Fig 4 Western blot analysis(by antihuman 2GPI mAb)蛋白稳定性 图5中的a，b，c显示室温下， 2GPI蛋白于不同浓度NaCl溶液中存放20，40和60 d的情况，d，e，f是在4条件下不同浓度NaCl溶液中存放20，40和60 d的情况。无论是室温还是4， 2GPI蛋白在低于 mol/L NaCl溶液中易分解成小片断，可见电泳图上在目标蛋白下方出现相对分子质量较
15、小的条带，且随存放时间延长会出现更低相对分子质量的条带，甚至目标条带完全消失。在 mol/L NaCl溶液中蛋白可于室温保存40天，保存60天则蛋白降解。在 mol/L NaCl溶液中2GPI蛋白稳定性好，室温及4存放60天均未见降解条带。 图5 提纯蛋白在不同浓度NaCl,不同温度,保存不同时间后蛋白电泳分析图Fig 5 Electrophoresis results of purified protein under different concentrations of NaCl, temperature and periods3 讨论 研究表明，在体外2GPI具有抗凝血功能，可以抑制血小板凝血酶原活性、抑制ADP诱导的血小板聚集过程及vWF依赖的血小板的黏附和聚集4，在体内2GPI及其抗体在抗磷脂综合征的病理过程中发挥重要作用。2GPI与其抗体形成复合物可刺激血管内皮细胞、血小板、单核细胞表达各种炎性因子、促凝蛋白等，从而引起高凝状态。然而， 2GPI及其抗体是通过何种通路引发这些因子的表达尚未清楚，也是抗磷脂综合征药物治疗的关键，尚需深
