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1、来自人类排泄物中的新属新种-Subdoligranulum variabile摘要在研究人类排泄物中的菌群时，我们分离出了一个菌种，这个菌种是严格的厌氧的，无芽孢，革兰氏染色为阴性并且呈现多样性的球菌形态。从系统发育看，相对的16S核糖体RNA基因序列研究表明未知的菌群是柔嫩梭菌亚属rRNA簇的一个成员。并且与来自人类和猪的排泄物的一些rDNA表现了密切的关系。和这种已分离未知菌体关系最近的已命名的菌体是Faecalibacterium prausnitzii (以前的Fusobacterium prausnitzii)，并且与Faecalibacterium prausnitzii的16sR
2、NA序列表现出接近9%的分离比，Anaerofilum agile 和 A. pentosovorans与未知的菌体表现了第二亲密的关系（序列分离率接近10%）。基于表型和系统发育的考虑，这个不寻常的球状菌体被归类为一个新的属和种- Subdoligranulum variabile。这个模式菌株S.variabile叫做BIT (=CCUG 47106T=DSM 15176T)。1. 简介相对小亚族16S rRNA的系统发育分析改变了我们对于人类肠道微生物多样性的认识。尽管长期以来我们认为人类胃肠道是由大量的多样性厌氧细菌构成的，但是随着独立培养研究的到来，尤其是16S rDNA群落的分析，
3、这种多样性的范围才开始被揭露（例如1,2）。这和其它的一些研究表明：很大一部分的菌种迄今为止还未被分类学所描述1-3。尽管可能是由于许多的这样“隐蔽物种”是不可培养的，但是更可能是由于要把一些其它的菌种描述成特征明显的实体是困难的，因而在过去逃避了描述。16S rRNA基因序列分析正被看做一种从环境中筛选潜在的新奇的物种多样性的有力工具。的确，最近几年，同时利用这种分子诊断工具和培养方法已经导致了来自人类排泄物许多新颖的菌种的描述例如，4-8。在人类肠道微生物多样性研究的进程中，我们已经利用了前面提到的方法来帮助迄今为止未知菌种的鉴定。这种未知菌种属于Clostridium leptum rR
4、NA亚属簇之内。基于目前的研究发现，我们描述了一个新的属和种- Subdoligranulum variabile。2. 材料和方法2.1培养和生化特点从住在Hrsholm, Denmark47岁的女性排泄物样品中得到菌株BI114T。该菌株是从市场上买的Biolog Universal Anaerobe琼脂培养基上分离的，该培养基中添加了体积比例为5%的去纤维蛋白的小牛血液（简称BUA+B）(Biolog Inc., Hayward, CA, USA)，然后在37，N2, CO2 和 H2体积比为80:10:10%的气相条件下进行厌氧培养。该菌株也能在根据Barcenilla等人的文献所记录
5、的那样准备的液体培养基M2GSC（包含瘤胃液）中生长，在含有煮熟的肉颗粒的Fastidious Anaerobe液体培养基中也能生长。生长情况可以在37一周内每隔两天检测一次，检测时分别在需氧，微量需氧(含体积比为2%和6%氧气)，绝氧条件下进行。根据Holdeman10等人文献中所记录的那样，对发酵产物通过气液色谱法进行分析。对该菌株进行传统的生化检测10,11，并且该菌株可以在厂家指示的情况下，利用AN-MicroLog TM 系统(Biolog Inc., Hayward, CA, USA)和API ZYM 与Rapid ID 32A 系统 (API bioMerieux, Marcy
6、lEtoile, France)进行生化特征鉴定。2.2 生化分类特征提取长链细胞脂肪酸，然后利用Miller13修改方案进行甲基化12，再利用MIDI系统进行分析(MIDI, Newark, DE, USA)。在一种压力感受装置下对细胞进行破坏，然后进行DNA的分离，通过羟磷灰石层析而纯化。根据Mesbah14等人记录的那样用P1核酸酶和碱性磷酸酶对DNA酶解，之后利用高效液相色谱进行G+C摩尔百分含量的测定。2.3 系统发育特点利用通用引物pA(positions 8 to 28,Escherichia coli numbering) 和pH* (positions 1542 to 152
7、2)对分离菌株的16SrRNA基因进行PCR扩增。用QIAquick PCR purification试剂盒(Quiagen Ltd., Dorking,UK)对扩增产物进行纯化，然后利用直接指向rRNA基因保守序列的引物以及dRhodamine终止子循环序列试剂盒(PE Applied Biosystems, Inc., Foster City CA, USA)和自动DNA序列发生器直接进行测序。把分离菌株的16SrRNA基因序列和GenBank/EMBL进行比对（登陆号是AJ518869）。利用程序FASTA15进行数据搜索，然后得到和分离的新菌株亲缘关系最近的已知的菌株。从基因库数据中我
8、们获得的这些基因序列和其他已知的有关菌株的序列，并且利用程序DNATools16将新的已经了解的序列排列到一起。运用程序GeneDoc17校对结果得到的多样性的序列排列。用软件DNA Tools 和 TREEVIEW通过临近相连的方法构建系统发育树。利用相同的软件通过辅助程序分析（1000个重复）估计菌群的稳定性。2.4 16SrDNA PCR产物AluI酶切图谱分析为了快速地区别分离菌株BI 114T和菌株Faecalibacterium prausnitzii ATCC 27768T的不同，用限制性内切酶AluI酶切用保守引物616V(5,-AGAGTTTGATY MTG GCTC-3,)
9、和630R(5,-CAKA AAGGAGGTGATCC-3,)PCR产生的16SrDNA产物。然后将酶切的产物加入到2%的加有EB的琼脂糖凝胶中，再在紫外光照射下观察。3. 结果和讨论从人类排泄物中分离得到未知的菌类是严格的厌氧型，不能在氧气所占体积比为2%或6%的条件下生长。在BUA+B 琼脂培养基上，37培养4到5天后，该菌落的直径大小接近1毫米，表面呈灰白色，圆形，凹面。该菌株在TPY或者BHI琼脂培养基上不能够生长。它的细胞革兰氏染色为阴性，不能运动，并且为无芽孢。图1是一张从BUA+B琼脂培养基上获得的菌体的相差显微镜的照片。这个菌体趋向于两个细胞连接在一起，甚至在一些情况下三个细胞
10、可以连接在一起。菌体的大小在0.6到2.5微升，具有各种形状（圆形，椭圆形，或者是胶状）。该菌体可以在M2GSC液体培养基或者是有煮熟的肉颗粒的严格的厌氧液体培养基上生长。但是分离的BI 114T菌体在TPY或者BHI液体培养基上不能够生长。就像在相差显微镜中观察到的那样，在固体培养基上和液体培养基上生长的BI 114T菌体的细胞形态是相似的。这种微生物菌体生长需要多元的培养基，不能够在单一的已知成分的培养基中生长。它的最适生长温度是37，在30下不能生长，在45下能够较慢的生长。葡萄糖的最终代谢产物主要是酪酸和乳酸，以及少量的乙酸。该微生物能水解七叶灵，而不能水解淀粉。卵磷脂酶，脂肪酶和尿素
11、酶呈阴性。用AN-MicroLogTM这个系统，该菌体能利用许多糖类物质（即N-乙酰-D-葡萄糖胺，N-乙酰-D-甘露糖胺，扁桃苷，熊果苷，纤维二糖，葡聚糖，D-果糖，L-海藻糖，D-半乳糖，D-半乳糖醛酸，；龙胆二糖，-D-葡萄糖，葡萄糖1磷酸，葡萄糖6磷酸，-D-乳糖，乳果糖，麦芽糖，麦芽三糖，D-甘露糖，D-蜜二糖，3-甲基-D-葡萄糖，-甲基-D-半乳糖苷，-基-D-半乳糖苷，异麦芽酮糖，D-棉籽糖，L-鼠李糖，水杨苷，蔗糖，D-海藻糖和松二糖）。利用API Rapid ID 32A试剂盒，我们可以检测以下酶的活性：-牛乳糖苷酶，-牛乳糖酶，-葡糖苷酶，-葡萄糖醛酸酶，精氨酸芳基酰胺酶
12、，亮氨酸芳基酰胺酶和组氨酸芳基酰胺酶。-葡糖苷酶的活性比较低或者没有活性。用这个检测系统检测，其它的检测结果呈阴性。而用API ZYM系统检测时，-牛乳糖苷酶，-牛乳糖酶，-葡糖苷酶，-葡萄糖醛酸酶呈现阳性反应，-葡糖苷酶表现比较弱的反应。用这个试剂盒，其它的检测结果呈阴性反应。分离的球形菌体产生的长链细胞脂肪酸主要是由直链饱和和单一不饱和脂肪酸组成。主要是C16:0 (29.4%), C18:0 (10.3%) and C18:1 cis9(34.3%)，其它少量的成分对应是iso-C10:0 (0.2%), C10:0 (0.4%), C12:0(0.5%), C14:1 cis9 (0.
13、6%), C14:0 (5.5%), C14:0 DMA(0.5%), anteiso-C15:0 (0.2%), C16:0 ALD (2.8%),C15:0 (0.4%), iso-C16:0 (0.2%), C16:1 cis9 (4.7%),C16:0 DMA (4.6%), iso-C17:0 (0.3%), anteiso-C17:0(0.6%), C17:0 (1.1%), C18:1 cis9 DMA (1.7%), and C18:0 DMA (0.8%)。这个菌株DNA中 G+C 的含量被检测是52.2 mol%。为了确定还未鉴定的菌体在系统发育中的地位，我们通过PCR扩增
14、它的16S rRNA的基因片段，确定它的基因顺序，然后进行相对分析。基因库的搜索表明未知的菌体和微生物C. leptum rRNA 基因簇有最大的相似性（数据还未表明）。系统树分析已经证实了微生物中C. leptum基因簇和未知菌株的联系（图2）。这个未知的菌落和一些来自人类和猪肠道中的rDNA基因表现出和密切的关系。然而，和这个未知的分离菌株亲缘关系最近的已知命名的菌种符合Faecalibacterium prausnitzii菌株的要求，而Faecalibacterium prausnitzii菌株与Anaerofilum agile和A. pentosovorans菌种关系比较远。为了快
15、速地得到这个未知菌株和F.prausnitzii菌株的不同，我们用限制性内切酶AluI进行16SrDNA PCR产物的酶切。从菌株F.prausnitzii 16SrDNA已知基因序列我们可以看出AluI酶切可以得到长度分别接近800,480，170和70bp的4个基因片段，而分离的BI 114 T菌株预期可以由16SrDNA序列产生的片段大小为：800,480和另外一个接近250bp长度的片段。尽管在电泳条带上没有看见F.prausnitzii菌株所预期的70bp长度的片段，但是对于BI 114T菌株来说，电泳以后的条带确实得到了以上3条片段。电泳图谱中两个小的基因片段的条带位置的不同清楚地
16、证明了两个种之间的差异，同时在两个菌株共同的比较大的片段则表明两个菌株比较远的亲缘关系。从系统发育分析可以清楚地看出：从人类排泄物中获得的未知菌株是菌群C. leptum rRNA簇的一个成员。这个未知分离的菌株与从人类3,19和猪20排泄物种获得的未培养的菌体的各种rDNA克隆基因呈现了很高的序列相似性（高达98%）。从系统发育树中可以明显的看出：许许多多储存在基因库中rDNA克隆基因序列和未知的菌株关系密切，然而其它基因与未知菌株的多少有点远。例如，来自人类排泄物中的菌株AF1322371和来自猪肠道的菌株AF37171520, 这对克隆基因和未知的分离菌株表现了将近4%的分离比，然而来自猪的三个菌株AF371722,AF371720和AF3712120的小的基因克隆簇和未知的分离菌株有比较远的亲缘关系（将近6-7%的分离比）。尽管鉴定和未培养的克隆基因有亲缘关系的未知分离菌株的等级分类是困难的，但
