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1、同位素标记法同位素标记法：同位素可用于追踪物质的运行和变化规律。借助同位素原子以研究有机反应历程的方法。即同位素用于追踪物质运行和变化过程时，叫做示踪元素。用示踪元素素标记的化合物，其化学性质不变。科学家通过追踪示踪元素标记的化合物，可以弄清化学反应的详细过程。这种科学研究方法叫做同位素标记法。同位素标记法也叫同位素示踪法。原理与特点基本原理同位素示踪所利用的放射性核素（或稳定性核素）及它们的化合物，与自然界存在的相应普通元素及其化合物之间的化学性质和生物学性质是相同的，只是具有不同的核物理性质。因此，就可以用同位素作为一种标记，制成含有同位素的标记化合物（如标记食物，药物和代谢物质等）代替相
2、应的非标记化合物。利用放射性同位素不断地放出特征射线的核物理性质，就可以用核探测器随时追踪它在体内或体外的位置、数量及其转变等，稳定性同位素虽然不释放射线，但可以利用它与普通相应同位素的质量之差，通过质谱仪，气相层析仪，核磁共振等质量分析仪器来测定。放射性同位素和稳定性同位素都可作为示踪剂（tracer），但是，稳定性同位素作为示踪剂其灵敏度较低，可获得的种类少，价格较昂贵，其应用范围受到限制；而用放射性同位素作为示踪剂不仅灵敏度，测量方法简便易行，能准确地定量，准确地定位及符合所研究对象的生理条件等特点：灵敏度高放射性示踪法可测到10-1410-18克水平，即可以从1015个非放射性原子中检
3、出一个放射性原子。它比目前较敏感的重量分析天平要敏感108-107倍，而迄今最准确的化学分析法很难测定到10-12克水平。方法简便放射性测定不受其它非放射性物质的干扰，可以省略许多复杂的物质分离步骤，体内示踪时，可以利用某些放射性同位素释放出穿透力强的r射线，在体外测量而获得结果，这就大大简化了实验过程，做到非破坏性分析，随着液体闪烁计数的发展，14C和3H等发射软射线的放射性同位素在医学及生物学实验中得到越来越广泛的应用。定位定量准确放射性同位素示踪法能准确定量地测定代谢物质的转移和转变,与某些形态学技术相结合（如病理组织切片技术，电子显微镜技术等），可以确定放射性示踪剂在组织器官中的定量分
4、布，并且对组织器官的定位准确度可达细胞水平、亚细胞水平乃至分子水平。符合生理条件在放射性同位素实验中，所引用的放射性标记化合物的化学量是极微量的，它对体内原有的相应物质的重量改变是微不足道的，体内生理过程仍保持正常的平衡状态，获得的分析结果符合生理条件，更能反映客观存在的事物本质。 放射性同位素示踪法的优点如上所述，但也存在一些缺陷，如从事放射性同位素工作的人员要受一定的专门训练，要具备相应的安全防护措施和条件，在目前个别元素（如氧、氮等）还没有合适的放射性同位素等等。在作示踪实验时，还必须注意到示踪剂的同位素效应和放射效应问题。所谓同位素效应是指放射性同位素（或是稳定性同位素）与相应的普通元
5、素之间存在着化学性质上的微小差异所引起的个别性质上的明显区别，对于轻元素而言，同位素效应比较严重。因为同位素之间的质量判别是倍增的，如3H质量是1H的三倍，2H是1H的两倍，当用氚水（3H2O）作示踪剂时，它在普通H2O中的含量不能过大，否则会使水的物理常数、对细胞膜的渗透及细胞质粘性等都会发生改变。但在一般的示踪实验中，由同位素效应引起的误差，常在实验误差内，可忽略不计。放射性同位素释放的射线利于追踪测量，但射线对生物体的作用达到一定剂量时，会改变机体的生理状态，这就是放射性同位素的辐射效应，因此放射性同位素的用量应小于安全剂量，严格控制在生物机体所能允许的范围之内，以免实验对象受辐射损伤，
6、而得错误的结果。标记实验的设计原则设计一个放射性同位素的标记实验应从实验的目的性，实验所具备的条件和对放射性的防护水平三方面着手考虑。原则上必须从两个主要方面来设计放射性标记实验：一是必须寻求有效的、可重复的测定放射性强度的条件，二是必须选择一个合适的比活度q（单位是原子/时间/分子，dpm/mol或ci/mol）。其中，=-dNdt/N为该处放射性原子核的衰变常数。q=N /n，表示n个该化学形式分子为N个放射性原子所标记。=n/n表示放射性标记的分子数n与总分子数（标记的加未标记的）n之比。采用放射性同位素标记技术来实现所研究课题预期目的全部或一部分，一般须经过实验准备阶段，实验阶段和放射
7、性废物处理三个步骤。（一）实验准备阶段1、标记剂的选择选定放射性标记剂的比活度q的值必须足够大，以保证实验所需要的灵敏度，而又要尽可能地小，使得在该实验条件下辐射自分解可忽略。一般情形是根据实验目的和实验周期长短，来选择具有合适的衰变方式，辐射类型和半衰期，且放射毒性低的放射性同位素。至今已确定的放射性核素包括天然的58种和人工制造的约1300种，其中大多数不常能用作放射性标记剂。主要原因是制备困难、半衰期不合适及放射性不足以定量。在任何一种生产方法中，生产步骤很可能包含或多或少的化学处理，因而标记实验人员需要了解某个核素及其周围的那些元素的化学性质，因为它们有可能成为此放射性同位素的杂质。放
8、射性同位素都衰变（经过或不经过中间状态）到处于基态的子体核素，衰变时伴随各种形式的能量辐射，如、-、+、X放射等。在选择标记剂时，标记实验人员要仔细研究衰变纲图，根据实验条件和计数条件来决定那一种辐射，在衰变纲变内，代表核能级的两条水平线之间和距离表示能量差，或表示能级同伴随原子序数增或减少的能量，表示从激发态至基态的同质异能跃迁。一般要选择最适宜的半衰期的放射性同位素，使足够长，从而使衰变校正有意义或干脆不必作衰变校正，同时又要足够短，能较安全地进行标记实验，并使得放射性废物容易处理，在实际工作中，使用的放射性同位素的半衰期应该与实验需要持续的时间t相适应，如对于某个实验，t/=0.04时，
9、应所选放射性同位素的衰变校正为3.5%；而t/=0.10时，应选放射性同位素的衰变校正为6.6%。t/=0.15时，应选用其衰变校正为10%。在体外标记条件，一般选用半衰期较长而射线强度适中，既利于探测，又易于防护和保存的放射性标记剂。体内标记条件下，若实验周期短，应选用半衰期短，且能放出一定强度r射线物放射性同位素，若实验周期长，如需要将动物活杀后对组织脏器分别测定的，则应选用半衰期较长放射性同位素。此外，根据实验目的来选用定位的或不定位的标记标记剂，例如研究氨基酸的脱羧反应，14C应标记在羧基上，只有这种定位标记的氨基酸，才能在脱羧后产生14CO2。而有些实验不要求特定位置标记，只须均匀标
10、记即可。选择放射性标记剂还必须同时满足高化学纯度，高放射性核纯度的要求。在标记剂制备期间、贮存期间以用试验体系中所使用的溶剂、化学试剂、酶等可能会产生化学杂质、放射化学杂质及辐射自分解引起的放射性杂质，这些杂质的存在，使得标记实验中使用的标记剂不“纯”，而或多或少影响实验的结果，甚至会导致错误结论。氚标记的胸腺嘧啶核苷（3HTdR）和尿嘧啶核苷（3HUR）是两种常用的标记剂，前者有效地结合到DNA中，后者则掺入到RNA中，它们的辐射分解速度随比较放射性的增高及保存时间的延长而增加，在不同温度和不同溶液中的稳定性也不同。经保存八年的3H-TdR约有35%辐射分解为3H胸腺嘧啶，并导致二醇和水合物
11、的形式，在实验中这杂质会很快掺入细胞并与大分子（很可能是蛋白质）结合，而不是与DNA和RNA相结合，这些杂质用DNA酶和RNA酶处理细胞都不除去。3HTdR和3HUR贮存在-20的冷冻溶液中辐射分离速度要比+2增加34倍，但低温度（-140）对贮存也有利，在允许对标记实验人员在选择保存放射性标记剂时会有所启发。2、放射性同位素测量方法的选择测量方法的选择取决于射线种类，对于射线通常可用硫化锌晶体、电离室、核乳胶等方法探测；对能量高的射线可用云母窗计数管、塑料闪烁晶体及核乳胶测定，对于能量低的射线可用液体闪烁计数器测量：对于射线则用G-M计数管，碘化钠（铊）闪烁晶体探测。目前大多数实验室主要采用
12、晶体闪烁计数法和液体闪烁计数法两种测量方式。同一台探测仪器对不同量的标记剂具有不同的最佳工作条件，在实验准备阶段要检查探测器是否已调有所用标记同位素的工作条件，否则需要用一定量的标记剂作为放射源（或选用该同位素的标准源），把探测器的最佳工作条件调整好，并且要保证探测器性能处于稳定可靠的状态。探测最佳工作条件的选择方法：一种是测“坪曲线”，另一种是找最好的品质因素。对于光电倍增管，在理论上不存在“坪”（plateau）。但随着高压的增加，在一定范围内，脉冲数变化较小，形成一段坡度较小的电压脉冲曲线，通常也称其为坪。测坪曲线的方法：固定放射源，根据其射线能量的大小，初选 一个广大器增益（放大倍数）
13、和甄别器阈值。不断地改变高压（由低到高，均匀增加伏度），每改变一次高压，都测定一次本底和放射源的计数率，最后作出高压本底计数率和高压放射源计数曲线。用同样的方法，作另一个甄别阈值（放大倍数不变）下的高压计数率曲线，这样反复多作几条曲线。必要时，还可固定甄别阈值，改变放大倍数，求出高压计数率曲线。应选择“坪”比较平坦的曲线工作条件：甄别阈值和放大增益，作为正式测定时间的仪器工作条件，高压值应选择在该“坪”中点偏向起始段一边相应的高压值。品质因素，又称为优值，是指在一定条件下，要达到合适的统计数目所需要的时间是仪器的计数效率E和本底计数Nb的函数： 品质因素F=E2/Nb它是衡量一台计数器性能的指
14、标，仪器的品质因素F应该越大越好，品质因素F越大，表示测量效率E越高而本底Nb越小。如果某放射性标记的标准源存在来源困难等问题的话，可以用相对品质因素f来代替。 相品质因素f=ns/nb 式中ns指某种放射性样品的计数率。找最好品质因素的方法与测坪曲线一样，作出几条高压F（或f）的关系曲线，在几条曲线中选择峰值最高的曲线。这根曲线的峰值所对应的条件：高压，甄别阈，放大倍数等，就是该仪器对被测同位素的最佳工作条件。最佳品质因素不一定恰好落在“坪”上，有的在“坪”附近，有的却在“坪”的下端。着眼于把同位素的整个能谱峰都计下来的标记实验者主张取“坪”所对应的工作条件，而着眼于优值者，主张取最佳品质因
15、素所对应的工作条件，也有人折衷。如果某仪器本底很低，光电倍增管噪音很低和能谱分辩高，二者应该相差不大。同一台仪器的最佳工作条件，随仪器的使用期延长而有所改变，不同的放射性同位素，其最佳工作条件不同。因此核探测仪器的最佳工作条件具有专属性，并且要经常通过选择其不同时期的最佳工作条件。更不能不问被测同位素的种类，而千篇一律地使用同一个工作条件。为了达到准确地计数，可以长时间一次计数，或短时间多次测量，两者达到的标准误基本相同，为避免外界因素的影响，在实际工作中，取短时间多次测量较为合理适用。在测量样品的放射性时，本底是一个重要影响因素。本底高，则标准误和标准误差都增大，尤其在样品计数较低时，本底对
16、标准误和标准误差的影响就愈大，从而影响实验结果的精度，而且为了达到一定的精度，势别要增加样品的测量时间。根据核衰变的统计规律，在实验中如果样品数量少，选择tN=1.4tb的比例（式中tN为样品放射性测量时间，tb为本底测量时间）较为合理；如果样品数量较多是一大批样品，则延长本底测量时间tb，取tb的时间均值，而tN则可相对短，这样可节省时间，有利于缩短实验周期。对于标记实验设计来说，样品中所含放射性强度的要求，是使其放射性计数率大于或等于本底计数的1020倍。3、进行非放射性的模拟实验，把实验全过程预演一遍同位素标记实验要求准确、仔细，稍有疏忽或考虑不周就匆忙进行正式实验，既容易导致实验失败，又会造成标记剂和其它实验用品的浪费，还会增加放射性废物，增加实验室本底水平，使实验者接受不必要的辐射剂量，所以模拟实验不仅可以检查正式实验中所用器材，药品是否合格，又可以操作人员进行训练，以保证正式实验能
