实时荧光定量原理taqman探针简介

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1、实时荧光定量原理taqman探针简介实时荧光定量PCR技术原理与应用聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 。在扩增反 应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通 过 放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析 。无论定性还是定量分 析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信 号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者 某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而 生。所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个

2、循环产物荧光 信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反 应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累 计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样 我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图图 1 实时荧光扩增曲线图一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段 , 荧 光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景 信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模

3、板量之间没有线性关系，所以根 据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶 段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个 阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了 两个非常重要的概念:荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定 的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域 值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧 光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）（如图

4、 2 所示）。图 2. 荧光定量标准曲线CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， CT 值越小。利用已知起始拷贝数的标准 品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct 值（如图 3 所示）。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的 起始拷贝数。图 3 阈值线和 CT 值荧光探针和荧光染料实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与 靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特 殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探

5、针的识别步骤，特异性更高， 但后者则简便易行。TaqMan 探针P p d y m o r i /| i gs n G 0 m p I 门 * dTaqMan 探针是多人拥有的专利技术。 TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它 的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序 列配对。荧光基团连接在探针的 5 末端，而淬灭剂则在 3 末端。当完整的探 针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3 端的淬灭剂接近而被淬灭。 但在进行延伸反应时，聚合酶的 5 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团 与淬灭剂分离。 TaqMan 探针适合于各种耐热的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶（ MJ Research 公司有售）。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团 不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。