液相色谱串联质谱的小知识

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1、一、开机 water 2695/micromass zq4000:开机步骤1。分别打开质谱、液相色谱和计算机电源，此时质谱主机内置的CPU会通过网线与计算机 主机建立通讯联系，这个时间大约需要1至2分钟。2. 等液相色谱通过自检后，进入Idle状态，依照液相色谱操作程序，依次进行操作。(具体 根据液相色谱不同型号来执行，下面以2695为例)。a。打开脱气机(Degasser On)。b。湿灌注(Wet Prime)。c。Purge Injector。d。平衡色谱柱。3. 双击桌面上的MassLynx 4。0图标进入质谱软件.4。检查机械泵的油的状态(每星期)，如果发现浑浊、缺油等状况，或者已经

2、累积运行超过 3000小时，请及时更换机械泵油.5点击质谱调谐图标(MS Tune)进入质谱调谐窗口 6选择菜单“Options - Pump”，这时机械泵将开始工作，同时分子涡轮泵会开始抽真空。 几分钟后，ZQ就会达到真空要求,ZQ前面板右上角的状态灯“Vacuum”将变绿。7。点击真空状态图标，检查真空规的状态，以确认真空达到要求.8。确认氮气气源输出已经打开，气体输出压力为90 psi。9。设置源温度(Source Temp)到目标温度。关机1. 点击质谱调谐图标进入调谐窗口。2. 点击Standby 让MS进入待机状态时，这时状态灯会由绿变红，这一过程是关质谱高电 压的过程。3. 停止

3、液相色谱流速，如果还需要冲洗色谱柱，可以将液相色谱管路从质谱移开到废液瓶。4. 等脱溶剂气温度(ESI)或APCI探头温度降到常温，点击气体图标关闭氮气。5. 逆时针方向拧开机械泵上的Gas Ballast阀，运行20分钟后关闭(镇气)。a) 对于ESI源，至少每星期做一次.b) 对于APCI源,每天做一次。6. 再次确认机械泵的Ballast阀是否已经关闭。7. 选择Option / Vent,这时质谱开始泄真空，ZQ前面板的状态灯“Vacuum”开始闪烁，几 分钟后机械泵会停止运行，这时可以关闭质谱电源。FINNIGEN DECA开关机及校正流程-一1开机前准备事项(1) 确保质谱总电源开

4、关(白色开关)及主板电源开关(黑色开关)处于关闭状态 (O);(2) 检查真空泵油液面，确保泵内油页面处于标定的上下两线之间；(3) 查看离子源洁净程度，ESI源查看喷口是否有固体析出，毛细管口是否完好； APCI喷口是否有积液；(4) 气体压力，打开高纯氮气钢瓶总阀，调节出口压力调至0.65MPa,打开高纯氦气 钢瓶总阀，调节出口压力调至0.25Mpa;(5) 检查壳气及辅助气接口连接紧固，松开液相管路与离子源的接口；(6) 开启动力电源,电压稳定,正常；（7）确保室内温度在1825度。二找方法a、其实做方法 不是很难的，先找MS的条件，然后建立MRM连上液相找液质方法就可 以了，然后在优化

5、离子源 气体流量，以及温度就可以了。b、首先，我们应该知道被测化合物的结构式 pKa，溶解度等理化性质。1，根据化合物极性和分子量大小选择离子源，非极性强的化合物可用APCI源，非极性弱的 用ESI,此外ESI可形成多电荷离子，适合检测多肽等分子量大的化合物（APCI则不行）。2, 根据化合物的酸碱性选择用正离子或负离子：一般碱性化合物用正离子，酸性或中性化 合物选择负离子.正离子条件下:流动相一般加0。01-0o 1%的甲酸，负离子条件下：流动相一般加0。01-0.1%的甲酸铵。3, 离子源和正负条件确定好后即可优化化合物的质谱参数：建议先搞清楚各个参数是与流速相关还是与分子量相关，与TSQ

6、 Quan tumn为例： 与流速相关的参数有：Spray voltage,Sheath gas, Aux gas， Capillary temperature等 参数，如果流速在较低范围内变动，这些参数就不用优化，使用厂家的推荐值即可。与分子量相关的参数有Tube lens offset等参数，这个一般也不建议优化。使用校正表上 的值即可。所以这一步最关键的是找到母离子，如有加合离子建议加大Source CID试试，给一定能量 看看打碎的主要子离子。注意：如让仪器自动找子离子也能找到，但其优化的碰撞能量一般偏高，一般需要在其基础 上减去Source CID的值大小即可C、如果是简单的定性，对

7、于锥孔电压没什么太苛刻的要求。但是如果是要对样品进行定量， 特别是低含量的，要讲究灵敏度，那就我对单个样品直接进样，分别优化毛细管电压和锥孔 电压.三质谱仪按质量分析器（或者磁场种类）可分为静态仪器和动态仪器，即稳定磁场（单聚焦及双聚焦质 谱仪）和变化磁场（飞行时间和四极杆质谱仪）。MS仪器一般由进样系统、电离源、质量分析器、真空系统和检测系统构成。1、真空系统质谱仪中所有部分均要处高度真空的条件下（10-4106Torr或mmHg）,其作用是减少离 子碰撞损失。真空度过低，将会引起：a）大量氧会烧坏离子源灯丝；b）引起其它分子离子反应，使质谱图复杂化；c）干扰离子源正常调节；d）用作加速离子

8、的几千伏高压会引起放电。2、进样系统对进样系统的要求：重复性、不引起真空度降低。进样方式：a）间歇式进样：适于气体、沸点低且易挥发的液体、中等蒸汽压固体。如图所示注入样品（10100& #61549;g）贮样器（0。5L3L）抽真空（102 Torr）并加热 样品蒸分子（压力陡度）漏隙高真空离子源。b）直接探针进样:高沸点液体及固体探针杆通常是一根规格为25cm6mm i。d.,末端有一装样品的黄金杯（坩埚），将 探针杆通过真空闭锁系统引入样品，如图所示。我们试验室用的是ABI 3000质谱仪，主要定量分析生物样品。LC-MS/MS方法学开发的一般步骤是首先通过微量注射泵获得母

9、离子和子离子以及DP CE这四个主要参数然后利用梯度程序考察流动相组成（包括有机相的比例，甲酸或缓冲盐的加入量）对质谱响 应的影响。流动相的组成确定后利用FIA优化确定其他参数，主要是气体参数和TEM IS。一台LC/MS由以下几部分组成：HPLC、离子源接口、离子束聚焦、质量分析器、离子检 测器、数据处理、化学工作站。HPLC就不说了，先说离子源，目前比较好的离子源设计为Agilent的直角喷雾技术，好处：1。去溶剂效果好，耐受液相高流速2。雾化针零电位，位置免调整操作安全简便，重现性 好；3。离子截取面积大，灵敏度高；4。反吹干燥氮气，有效阻挡中性分子，减少污染并保 护真空；5。大口径非加

10、热石英毛细管，离子传输效率咼，有利于咼灵敏度检测；有效防止 样品热降解;调谐稳定，碰撞诱导解离（CID）谱图重现性好;6。铰链设计，不同离子源的切 换，简单方便，易于操作。下面说质量分析器：没有一种质量分析器可以适用于所有领域，目前的质量分析器有： 单四极杆质谱、三级串联质谱、离子阱质谱、飞行时间质谱、四极-飞行时间质谱.离子检测器：电子倍增管（EMT）：经质量分析器分离出来的离子首先撞击高能转换打拿极发 射二次粒子，正、负离子转换的二次粒子最终均为电子；随后发射的电子进入电子倍增器的 弯曲形内壁，撞击管壁涂层，产生更多的二次电子；最后以电信号输出电子倍增管的放大 倍数约为107。光电倍增管（

11、PMT）：经质量分析器分离出来的离子首先撞击倍增管最前端的闪烁晶体发 射光子，光子照射光阴极射线管而发射电子,随后发射的电子进入电子倍增管进行信号放大， 最终同样以电信号输出。微通道板（MCP）:由一组圆柱形微通道管组成，每个微通道管的作用与电子倍增管类似。 当离子进入微通道管时,产生二次电子，反射通过这些微通道管时，不断产生更多的电子。MCP的最大优点在于具有超快的时间响应。如果将几块微通道板用适当的方法叠在一起放 大倍数将达108。ESI是气相离子化过程，主要包括三个步骤：1、在喷雾毛细管尖端产生带电液滴;2、通过溶剂蒸发和雾滴分裂使带电液滴变小，这个过 程反复进行；3、由很小的带电雾滴产

12、生气相离子。一般情况下，甲醇一水系统已能满足多数样品的分离要求，且流动相粘度小、价格低，是反 相色谱最常用的流动相。但Snyder则推荐采用乙腈-水系统做初始实验，因为与甲醇相比， 乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外185205nm处检测的要求，因此，综合 来看，乙腈一水系统要优于甲醇一水系统。四液质经验我认为要维护好仪器，首先流速不能过大，液质是不能承载过大流速的；其次电压不要加到极限，尤其是正负离子转换时要适当调整；最后是做完样一定要及时冲洗和吹扫管路。做液质时跑一针的时间最好不要 超过45分钟,否则仪器会很累。另外我认为API4000定量很准，但是打多级碎片时最好用的是离子阱，

13、因为它能够在一次进样后同时分析多 个离子，很方便，而不像四级杆一次只能进行一种离子的多级研究。1、由于液质的流速较小（ESI 般为0.2ml/min），所以配置样品的溶剂强度不能太大，尽量小于起始比例， 否则，会出现保留时间偏移等问题。2、如果在液相上摸好的条件，注意尤其是流动相的组成要转化成合适LCMS分析的.3、磷酸盐及其他不挥发缓冲盐在离子源会沉淀并堵塞毛细管等，要更换成可挥发的有机缓冲盐。4、缓冲盐会导致离子抑制，因此要控制缓冲液的强度,10mM。5、去污剂、表面活性剂会有离子抑制现象发生，表面活性剂产生的加合物和离子簇会干扰质谱数据，因此 作液质联用仪时，不要使用洗涤剂清洗玻璃器皿等

14、容器，如果一定要用，建议超声清洗多次.比如分析的样品必须要干净，这样既可以保护色谱柱,也可以防止污染质谱；分析了大量的生物样品后，冲 洗系统时，先用高比例的水相冲洗，把源也给洗一下，然后再换用高比例的有机相，这时要把柱后管路从 源上拿下来，避免柱中的杂质给冲进质谱1前处理：样品一定要干净，不管是为了质谱还是为了保护柱子，生物样品提取的好些， 如果直接沉淀，一定要注意，尽量高转速12000rpm以上，低温离心，最好离2次（保险一点）， 转移样品也要仔细，从中间慢慢吸，有时会有漂浮物，岛津的质谱好像做直接沉淀的源比较 容易堵，Waters的好些.2。样品浓度：质谱是灵敏度很高的仪器，进样浓度一定不

15、能太高,1 2ug/ml已经可以啦， 太高的浓度对仪器来说比较容易造成残留，而且定量也会不准啦。3流动相:流动相中尽量加易挥发的盐，尽量不要加表面活性剂之类的，容易离子抑制，如 果遇到离子抑制，可以试试把你的样品峰往后推推或者改变提取方法，也可以试试用APCI 源。如果你的液相是低压混合的，尽量不要跑梯度，那样很费时间，如果没办法，一针又要 走很长时间的话,可以考虑切换，只测样品出峰前后的那段时间，这样可以保护质谱。但是 如果你用粗柱子，较高流速的也可以考虑跑梯度，如API4000，但要尽量减小死体积。4。冲洗:冲柱子自然不用说了，低有机相和高有机相分别冲一定时间（各至少半个小时以上 吧），柱子保存在高有机相中。做完试验，冲源也是很重要的，也是低有机相和高有机相冲， 但是时间可以不用那么长，你可以先冲源再冲柱子，或者两者分开冲，个人觉得分开冲好些， 这样柱子上的脏东西就不会进到源里面去啦。冲源的时候气可以关小些。waters的液质有在线除盐的功能1、样品必须过0。22um滤膜过滤，不得有颗粒物；2、上样的溶剂，必须是色谱纯，最好和你的流动相比例一致；3、反相体系，不允许用正己烷之类极性弱的溶剂溶解样品并上样.4、水，自然是纯净水了；5、样品不允许含有金属离子、表面活性剂（不要